卒中后抑郁大鼠小腦P38、BDNF改變的實(shí)驗(yàn)研究

劉欣躍， 王東玉， 隋汝波

卒中后抑郁(post-stoke depression，PSD)是卒中最常見的并發(fā)癥之一，占卒中患者的20% ～50%［1］，PSD是阻礙卒中患者神經(jīng)功能和日常生活能力恢復(fù)的重要因素，并與卒中患者的社交回避和病死率增高密切相關(guān)［2］。最近15年的研究報道的PSD患病率在5% ～63%之間［3］，總體發(fā)生率高達(dá)80%［4］，顯著增加了卒中患者的病死率［5］、致殘率［6］，降低了生存質(zhì)量［7，8］。因此進(jìn)一步深入研究PSD的發(fā)病機(jī)制從而制定經(jīng)濟(jì)有效的治療措施是防治PSD的必要途徑，具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。近年的大量研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥、抑郁等精神紊亂均與小腦病變有關(guān)，而小腦急性和慢性病變皆可引起小腦認(rèn)知情感障礙綜合征［9，10］。而且小腦功能低下的程度與抑郁的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［11］。本文通過對卒中后抑郁大鼠小腦組織P38、BDNF的觀察和比較，研究卒中后抑郁與小腦功能的關(guān)系，以進(jìn)一步闡明小腦功能的改變在PSD發(fā)病中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用健康雄性SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠72只，體重250～300g(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。許可證號:SCXK(遼)。實(shí)驗(yàn)動物級別:普通級。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 P38、BDNF試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 連續(xù)變倍體視顯微鏡160x:桂林儀器廠;石英自動雙重純水整流器:江蘇丹陽門石英玻璃廠;LEICA-RM-2135石蠟切片機(jī):德國;烘片、烤片機(jī):孝感市電子儀器廠;OLYMPUS萬能顯微鏡:日本;電熱干燥箱:余姚工業(yè)儀表二廠。

1.4 動物分組及實(shí)驗(yàn)方法 將實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1w，自然晝夜節(jié)律光照，自由攝食進(jìn)水，通風(fēng)良好，(21±2)℃恒溫。期間訓(xùn)練飲用蔗糖水消耗和曠野實(shí)驗(yàn)(open-field test，OFT)基線值。選擇評分相近大鼠72只，隨機(jī)分為4組，每組18只。對照組:給予假手術(shù)處理，除拴線不插入頸總動脈外，余同手術(shù)組;卒中組:行大腦中動脈閉塞(MCAO)術(shù);單純抑郁組:慢性不可預(yù)見的溫和刺激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法;卒中后抑郁(PSD)組:MCAO術(shù)后第3天加以慢性不可預(yù)見的溫和刺激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法。

1.5 動物模型的制備及處理

1.5.1 大鼠于局灶性腦缺血模型建立［12］(middle cerebral artery occlusion，MCAO)手術(shù)前 12h禁食不禁水。選用標(biāo)準(zhǔn)大鼠麻醉劑量，以10%水合氯醛3m l/kg-1經(jīng)腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)和迷走神經(jīng)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、ICA的顱外分支-翼腭動脈，在近心端結(jié)扎CCA，在頸總動脈分叉處結(jié)扎ECA，結(jié)扎翼腭動脈。將ICA遠(yuǎn)心端用動脈夾夾閉，距頸總動脈分叉處近心端0.5cm處將頸總動脈剪一小口，插入備好的碳素魚線，去除動脈夾，沿著ICA輕輕向前推進(jìn)，注意不要誤入翼腭動脈，當(dāng)?shù)竭_(dá)指定長度(18cm左右)時結(jié)扎ICA并固定魚線。假手術(shù)組動物，除手術(shù)過程中不插入錢栓以外，其他過程相同。以青霉素局部消毒后縫合皮膚。術(shù)后保持環(huán)境溫度在25℃ ～30℃左右。尤其要注意動物頭部的保溫。模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)Horner征。

1.5.2 建立大鼠卒中后抑郁模型CUMS 按Willner［13］和 Katz［14］方法:(1)禁食禁水 20h;(2)禁水17h;(3)傾斜鼠籠(45℃)17h;(4)持續(xù)光照17h;(5)濕籠(100g鋸屑+200ml水)21h;(6)4℃游泳5min;(7)水平搖晃5min;(8)行為限制2h;(9)夾尾1min;共9種刺激每天隨機(jī)采取一種。共18d。孤養(yǎng):將PSD和抑郁組動物單籠飼養(yǎng)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 行為學(xué)觀察和測試 CUMS開始第7、14、21天，行曠野實(shí)驗(yàn)測試，每周行蔗糖水實(shí)驗(yàn)并測量體重，應(yīng)激結(jié)束后行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。(1)曠野實(shí)驗(yàn):室內(nèi)隔音，測定5min水平和垂直運(yùn)動得分及中央格停留時間、修飾次數(shù)和糞便顆粒;(2)蔗糖水實(shí)驗(yàn):20h禁食禁水后，測定1h糖水飲用比例(糖水消耗/總液消耗×100%);(3)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn):連續(xù)觀察5min，累計大鼠在水中停止掙扎、成漂浮狀態(tài)的時間。

1.6.2 標(biāo)本制備 動物完成觀察后，于相應(yīng)時間點(diǎn)7d、14d、21d，在大鼠盡量安靜的條件下迅速斷頭取腦，在冰盤上迅速分離出病灶側(cè)的小腦組織，按以下不同方法進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。

1.6.3 HE染色 大鼠以10%水合氯醛(0.3 ml/100mg)腹腔注射麻醉，打開頸部，暴露頸右總動脈，插管，先輸注生理鹽水約50ml，然后輸注4%多聚甲醛約50ml，斷頭取腦。甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死中心(即最大層面)，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成4～6μm厚的切片，貼片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，分別觀察梗死中心區(qū)和梗死周邊區(qū)小腦組織的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)(每個觀察區(qū)選擇具有代表性指標(biāo)的樣本觀察結(jié)果并記錄)。

1.6.4 免疫組織化學(xué)檢測小腦組織P38、BDNF的表達(dá) 石蠟切片脫蠟水化→微波修復(fù)10min→滴加3%H2O2室溫孵育10min→PBS沖洗5min/次×3次→加封閉液，室溫放置20min→加一抗4℃過夜→PBS沖洗5min/次×3次→加B液→水育箱37℃溫育30min→PBS沖洗5min/次 ×3次→加C液，室溫下孵育30min→PBS沖洗5min/次×3次→DAB染色→自來水沖洗5min→DW浸洗30s→蘇木素復(fù)染→自來水沖洗5min→DW浸洗30s→分化液浸洗→自來水沖洗5min→DW浸洗30s→依次過梯度酒精→梯度二甲苯→封片。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察和測試 與卒中組相比，單純抑郁組大鼠體重和糖水消耗量下降，水平運(yùn)動及垂直運(yùn)動水平降低(P＜0.01);PSD組大鼠體重和糖水消耗量下降更為明顯，水平運(yùn)動及垂直運(yùn)動水平降低也最為明顯(P＜0.01)

2.2 小腦組織頂核區(qū)域的病理形態(tài)學(xué) HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察(×400)，每組均可見正常神經(jīng)元和損傷神經(jīng)元。正常神經(jīng)元核圓形，邊界及核仁清楚;損傷神經(jīng)元胞核腫大，偏位，核仁消失，胞漿著色淺、蒼白或核濃縮、深染，細(xì)胞呈三角形缺血性壞死變化。單純抑郁組、卒中組、PSD組上述表現(xiàn)更為明顯，并呈現(xiàn)出依次加重的趨勢。

2.3 小腦組織的免疫組織化學(xué) 免疫組化結(jié)果顯示，小腦組織的主要表達(dá)區(qū)域在其普肯耶纖維細(xì)胞層，小腦浦肯野細(xì)胞呈P38陽性反應(yīng)，細(xì)胞單層排列，呈梨形或燒瓶形，細(xì)胞直徑約25～30μm，陽性反應(yīng)產(chǎn)物為黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)，胞核淡染;

P38組間比較，對照組普肯耶纖維細(xì)胞表達(dá)正常，顏色著色最深，表達(dá)最為明顯(見圖1，放大倍數(shù)×400);單純抑郁組大鼠普肯耶纖維細(xì)胞數(shù)量減少，顏色著色與PSD組比較略深，表達(dá)為中等強(qiáng)度(見圖2，放大倍數(shù)×400)。卒中組大鼠普肯耶纖維細(xì)胞數(shù)量減少不明顯，且顏色較深，表達(dá)為極強(qiáng)度(見圖3，放大倍數(shù)×400);而PSD組大鼠普肯耶纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且顏色著色極淺，表達(dá)為弱強(qiáng)度(見圖4，放大倍數(shù)×400)。組內(nèi)比較，在時間點(diǎn)7d、14d、21d，卒中組普肯耶纖維細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定在一定程度，基本無加重趨勢。單純抑郁組與PSD組隨時間的延長普肯耶纖維細(xì)胞表達(dá)數(shù)量逐漸減少，且顏色逐漸變淺。

BDNF在浦肯野細(xì)胞也呈陽性表達(dá)，位于細(xì)胞質(zhì)，胞核淡染，陽性反應(yīng)產(chǎn)物為黃色。對照組普肯耶纖維細(xì)胞表達(dá)正常，顏色著色最深，表達(dá)最為明顯(見圖5，放大倍數(shù)×400);卒中組大鼠普肯耶纖維細(xì)胞數(shù)量減少不明顯，且顏色較深，表達(dá)為極強(qiáng)度(見圖6，放大倍數(shù)×400);單純抑郁組大鼠普肯耶纖維細(xì)胞數(shù)量減少，顏色著色與PSD組比較略深，表達(dá)為中等強(qiáng)度(見圖7，放大倍數(shù)×400);而PSD組大鼠普肯耶纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且顏色著色極淺，表達(dá)為弱強(qiáng)度(見圖8，放大倍數(shù)×400)。在時間點(diǎn)7d、14d、21d，卒中組普肯耶纖維細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定在一定程度，基本也無加重趨勢。單純抑郁組與PSD組隨時間的延長普肯耶纖維細(xì)胞表達(dá)數(shù)量也逐漸減少，顏色也逐漸變淺。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究著眼于對PSD大鼠行為學(xué)的觀察和測試、小腦組織普肯耶纖維細(xì)胞功能活性依賴蛋白突觸素P38、BDNF的表達(dá)及小腦組織病理形態(tài)學(xué)的觀察。與卒中組比較，單純抑郁組大鼠行為學(xué)觀察和測試、P38、BDNF的表達(dá)普遍減弱;與單純抑郁組相比較，PSD組大鼠行為學(xué)觀察和測試、小腦組織P38、BDNF的表達(dá)減弱的更為明顯。與單純卒中相比，PSD患者小腦功能可能發(fā)生了改變，或者可能小腦參與了PSD的發(fā)生，而且PSD患者認(rèn)知功能和精神癥狀和本實(shí)驗(yàn)PSD大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)相一致。卒中后任何部位的損害都可能通過該損害區(qū)與小腦間的雙向突觸聯(lián)系影響小腦功能，小腦病變皆可引起小腦認(rèn)知情感損害，而且小腦功能損害的程度與抑郁程度呈正相關(guān)，從而導(dǎo)致一種特殊的抑郁即PSD的發(fā)生。

突觸素P38是一種與突觸功能密切相關(guān)的膜蛋白，1985年Jahn［15］等首先在大鼠腦突觸囊泡中發(fā)現(xiàn)。它廣泛存在于機(jī)體所有神經(jīng)終末，特異性地分布于突觸前囊泡膜上，因其與神經(jīng)生長、修復(fù)、再生和突觸重塑密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，PSD組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)和小腦組織P38表達(dá)明顯下降，說明PSD大鼠小腦的功能受到損害，是何種機(jī)制導(dǎo)致PSD大鼠的小腦功能發(fā)生損害，目前國內(nèi)外研究較少，特別是小腦在PSD發(fā)病機(jī)制中的基礎(chǔ)研究國內(nèi)外更未見報道。

本文另一個反映小腦功能的蛋白質(zhì)為BDNF，它是一種具有強(qiáng)烈促生長能力和在其釋放、結(jié)合受體活動中有復(fù)雜的相互作用的物質(zhì)，對運(yùn)動神經(jīng)元有營養(yǎng)、修復(fù)和再生的作用。同樣在本實(shí)驗(yàn)中，PSD組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)和小腦組織BDNF表達(dá)也明顯下降，也同樣說明PSD大鼠小腦的功能受到損害，其具體發(fā)生機(jī)制也尚不明確。

由此我們推測，小腦功能低下可能參與了PSD的發(fā)生，而且近年大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了一個現(xiàn)象，即“交叉性小腦神經(jīng)功能聯(lián)系不全”，即任何部位的腦損害(如目前公認(rèn)的與抑郁發(fā)生密切相關(guān)的下丘腦、海馬等邊緣系統(tǒng)及額葉、基底節(jié)等區(qū)的卒中)都會通過該病變部位與小腦間的突觸聯(lián)系(如經(jīng)典的“額葉-腦橋-小腦”環(huán)路)引起對側(cè)遠(yuǎn)隔部位的小腦的血流和代謝下降，從而降低小腦功能［16］。而研究證實(shí)，小腦無論在解剖還是功能上都與大部分皮質(zhì)(包括額葉)及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)如下丘腦、海馬等邊緣系統(tǒng)有著廣泛的突觸聯(lián)系，這些區(qū)域正與情感密切相關(guān)［17］，PSD作為一種特殊的抑郁，也應(yīng)具有類似的表現(xiàn)。國內(nèi)劉竟麗等［18］應(yīng)用電刺激小腦頂核治療PSD患者，結(jié)果顯著改善了PSD患者的抑郁癥狀。這些研究進(jìn)一步提示小腦與PSD發(fā)病密切相關(guān)［19］。因此，更加深入的研究小腦功能與PSD的關(guān)系，可能有助于闡明小腦功能的改變在PSD發(fā)病中的作用機(jī)制提供了思路，從而制定經(jīng)濟(jì)有效的治療與預(yù)防措施，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

圖1 對照組

圖2 單純抑郁組(中等強(qiáng)度)

圖3 卒中組(極強(qiáng)度)

圖4 PSD組(弱強(qiáng)度)

圖5 對照組

圖6 卒中組(極強(qiáng)度)

圖7 單純抑郁組(中等強(qiáng)度)

圖8 PSD組(弱強(qiáng)度)

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