脊髓缺血再灌注損傷模型的改進(jìn)及對大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響

金 華， 郭光瓊， 李 江， 肖高鵬， 趙 強(qiáng)， 李艷華

臨床較為常見的胸、腹主動(dòng)脈瘤、脊柱骨折、脊髓供血?jiǎng)用}疾患、脊髓內(nèi)顯微外科手術(shù)、骶管腫瘤手術(shù)等常導(dǎo)致脊髓缺血損傷(spinal cord Ischemia injury，SCII)，引起急性或遲發(fā)性截癱的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。建立標(biāo)準(zhǔn)可靠的動(dòng)物模型對了解脊髓缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制，并進(jìn)一步研究脊髓保護(hù)和治療方案至關(guān)重要。目前通過結(jié)扎主動(dòng)脈模擬臨床脊髓血供障礙的模型多數(shù)在兔、狗、豬等較大型動(dòng)物實(shí)現(xiàn)，而對大鼠施行上述手術(shù)存在操作難度大、可重復(fù)性差等問題。本實(shí)驗(yàn)對傳統(tǒng)脊髓缺血損傷模型進(jìn)行改進(jìn)，對大鼠腎下腹主動(dòng)脈結(jié)扎同時(shí)切斷腎上腹主動(dòng)脈發(fā)出的椎動(dòng)脈以確保腰段脊髓血供被完全阻斷。此外，經(jīng)股動(dòng)脈置入導(dǎo)管既可以檢測阻斷部位以下血壓，又能成為局部注射藥物或生物制劑治療脊髓缺血的途徑。本研究建立SCII改良動(dòng)物模型并研究其對大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響，為進(jìn)一步研究脊髓缺血損傷的病理機(jī)制和治療方案提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 清潔級健康成年雌性SD大鼠56只，體重(220±10)g，隨機(jī)分為7組，每組8只。假手術(shù)(A)組僅行單純手術(shù)操作但不結(jié)扎腹主動(dòng)脈;對照1(B)組行腎下腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)60min后開放腹主動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)脊髓再灌注;對照2(C)組結(jié)扎腎下腹主動(dòng)脈90min后再灌注;對照3(D)組結(jié)扎腎下腹主動(dòng)脈120min后再灌注;改良1(E)組行腎下腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)并切斷腎上腹主動(dòng)脈發(fā)出的椎動(dòng)脈，阻斷血供60min后開放腹主動(dòng)脈再灌注。改良2(F)組行腎下腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)和椎動(dòng)脈切斷術(shù)，阻斷血供90min后再灌注;改良3(G)組行腎下腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)和椎動(dòng)脈切斷術(shù)，阻斷血供120min后再灌注。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號:SYXK(滇)2005-0004］。

清潔級健康成年雌性SD大鼠56只，體重(220±10)g，隨機(jī)分為7組，每組8只。假手術(shù)(A)組僅行單純手術(shù)操作但不結(jié)扎腹主動(dòng)脈;對照(B、C、D)組行腎下腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，分別阻斷腹主動(dòng)脈60min、90min、120min 后開放，脊髓再灌注;改良(E、F、G)組切斷腎上腹主動(dòng)脈發(fā)出的椎動(dòng)脈后結(jié)扎腎下腹主動(dòng)脈，分別阻斷血供60min、90min、120min后開放腹主動(dòng)脈再灌注。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號:SYXK(滇)2005-0004］。

1.2 缺血再灌注模型的建立和改進(jìn)

1.2.1 麻醉與檢測 以3.6%的水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉動(dòng)物，左側(cè)后肢根部去毛消毒，剪開皮膚，暴露左側(cè)股動(dòng)脈，明視下行股動(dòng)脈穿刺置入24號動(dòng)脈套管針，接壓力傳感器，以飛利浦M8003A型監(jiān)護(hù)儀(德國)監(jiān)測股動(dòng)脈平均壓(MAP)和脈率(PR)。將溫度探頭插入大鼠肛門持續(xù)監(jiān)測肛溫(Tr)，以燈泡維持大鼠肛溫于37℃ ～38℃。分別記錄各組腹主動(dòng)脈阻斷前(基礎(chǔ)值)、阻斷10min、再灌注10min時(shí)的上述指標(biāo)。術(shù)中視大鼠體動(dòng)和呼吸情況半量追加水合氯醛以維持麻醉效果。

1.2.2 動(dòng)物模型制作 取右側(cè)臥位固定大鼠，縱行切開左側(cè)腹部皮膚2～3cm，鈍性分離皮下組織，暴露后腹膜。游離左腎動(dòng)脈及其上、下各約1.5 cm長的腹主動(dòng)脈，注意保護(hù)淋巴管。以雙極電凝(威利FxTM-8C型電刀，美國)切斷左腎上動(dòng)脈分支以上腹主動(dòng)脈向脊髓發(fā)出的椎動(dòng)脈，隨后于左腎動(dòng)脈開口下方以4號絲線結(jié)扎腹主動(dòng)脈，阻斷血供。阻斷時(shí)，以股動(dòng)脈壓力波形消失，MAP≤10mmHg(1.33kPa)為標(biāo)準(zhǔn);開放時(shí)，以股動(dòng)脈壓力波形恢復(fù)為標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)脈結(jié)扎前經(jīng)股動(dòng)脈推注肝素20U預(yù)防血栓形成。術(shù)畢認(rèn)真檢查手術(shù)部位沒有滲血后逐層縫合。術(shù)后所有大鼠每天腹腔注射青霉素(20萬U)預(yù)防感染，對于術(shù)后截癱的動(dòng)物，每天早晚各一次按摩膀胱排尿，必要時(shí)給予開塞露排便。

1.2.3 標(biāo)本采集和處理 術(shù)后48h對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材，所有大鼠麻醉后仰臥固定，開胸左心室插管至主動(dòng)脈弓，右心耳剪一小口，生理鹽水灌注至清亮液體流出后將大鼠俯臥固定，切開背部皮膚和脊柱兩側(cè)肌肉，咬骨鉗咬開椎板，充分暴露脊髓，取出整個(gè)脊髓。截取L2節(jié)段脊髓置于4%多聚甲醛內(nèi)作后固定，再將標(biāo)本分別置于15%和30%梯度蔗糖液內(nèi)脫水。使用恒冷式切片機(jī)(Leica公司)連續(xù)冰凍切片，片厚20μm，貼片后37℃烤干備用。

1.3 模型評價(jià)指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)行為學(xué)評價(jià) 采用Basso［1］等提出的BBB評分體系于術(shù)后12h、24h和48h對所有大鼠進(jìn)行行為學(xué)評估，包括0～21級，完全功能缺失為0分，完全正常鼠為21分，評價(jià)的內(nèi)容主要包括大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙以及尾的位置等。評分者為3位熟悉評分標(biāo)準(zhǔn)的非本組實(shí)驗(yàn)人員，評分后取平均值。

1.3.2 NeuN免疫組織化學(xué)染色及脊髓前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù) 采用PV-9000兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色:0.01mol PBS沖洗切片5min×3次;3%H2O2去離子水浸泡10min，蒸餾水沖洗5min×2次;0.01mol PBS沖洗5min×3 次，甩去 PBS，5%羊血清封閉液室溫下孵育30min;在切片上滴加兔抗大鼠NeuN(1∶200，Chimecon，美國)，陰性對照以0.01 mol PBS替代一抗，4℃過夜;次日0.01mol PBS沖洗5min×3次，切片上滴加適量試劑1(PV-9000試劑盒)，室溫下孵育30min;0.01mol PBS沖洗5min×3次，甩去PBS，切片上滴加適量試劑2(PV-9000試劑盒)，室溫下孵育30min;0.01mol PBS沖洗5min×5次，甩去PBS，切片上滴加一滴新鮮配制的DAB顯色液，室溫下顯色3～5min，切片放入蒸餾水中終止顯色;將切片置入蘇木素染液中復(fù)染1min，自來水洗去玻片上多余雜液，返藍(lán)液返藍(lán)30s;常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封固;采用 leica application V 3.3.0數(shù)碼成像系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像采集，觀察脊髓組織病理學(xué)改變，并計(jì)數(shù)第Ⅷ、Ⅸ板層正常神經(jīng)元(正常神經(jīng)元定義標(biāo)準(zhǔn)［2，3］:細(xì)胞呈多角形，胞漿染為紅色，內(nèi)有正常的尼氏體;胞核居中，呈圓形，輪廓清晰，核仁明顯;胞體直徑30～60μm。同時(shí)滿足以上標(biāo)準(zhǔn)者為正常神經(jīng)元)。

2 結(jié)果

2.1 生理指標(biāo) 各組間MAP、PR、Tr基礎(chǔ)值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與本組基礎(chǔ)值比較，B、C、D、E、F、G 組 MAP 于阻斷 10min 時(shí)顯著降低(P＜0.01)，再灌注10min時(shí)明顯回升(與同組阻斷10min比較，P ＜0.01)但仍低于基礎(chǔ)值(P ＜0.01);各組PR和Tr于各時(shí)點(diǎn)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表1)。

2.2 神經(jīng)行為學(xué)評分(BBB評分) 與A組比較，各組行腹主動(dòng)脈阻斷術(shù)大鼠BBB評分于術(shù)后12h、24h、48h 均顯著降低(P ＜0.01)，其中以12h 時(shí)降低最為顯著，隨時(shí)間延長，各組BBB評分存在不同程度的回升(與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.01);D組BBB評分于術(shù)后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于B組和C組(P ＜0.01)，而明顯高于 E、F、G 組評分(P ＜0.01);B組與C組比較，BBB評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ＞0.05);E組術(shù)后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB評分均顯著高于F組和G組(P＜0.01)，G組評分于術(shù)后12h、24h與 F組比較無差異(Ρ ＞0.05)，于術(shù)后48h低于F組(P＜0.01)(見表2)。

2.3 病理學(xué)觀察及神經(jīng)元計(jì)數(shù) A組脊髓灰質(zhì)內(nèi)可見大量大小不一的NeuN免疫陽性細(xì)胞分布，前角Ⅷ、Ⅸ板層神經(jīng)元胞體體積明顯大于周圍的細(xì)胞，細(xì)胞呈多角形，胞體呈特征性的突起結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核深染，體積大而圓，核仁明顯，而胞漿和突起染色較淺。F、G組大量神經(jīng)元出現(xiàn)胞體萎縮、空泡樣變，胞漿中尼氏體消失，細(xì)胞核破裂，染色質(zhì)溶解、邊聚，Ⅷ、Ⅸ板層內(nèi)正常神經(jīng)元數(shù)明顯低于其它各組(Ρ＜0.01)。E組僅部分神經(jīng)元出現(xiàn)胞核溶解、破裂，Ⅷ、Ⅸ板層內(nèi)正常神經(jīng)元數(shù)低于 A組(P＜0.01)。B、C、D 組灰質(zhì)內(nèi)細(xì)胞形態(tài)及Ⅷ、Ⅸ板層內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量與A組相比無差異(P＞0.05)。

表1 7組大鼠不同時(shí)刻MAP、PR、Tr的比較(χ ± s，n=8)

表2 7組大鼠術(shù)后不同時(shí)刻BBB評分比較(χ ± s，n=8)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過電凝腎上腹主動(dòng)脈發(fā)出的椎動(dòng)脈和結(jié)扎腎下腹主動(dòng)脈阻斷腰段脊髓血液供應(yīng)的方法，有效降低阻斷后股動(dòng)脈壓力，并于開放腹主動(dòng)脈后實(shí)現(xiàn)脊髓再灌注。改良脊髓缺血再灌注損傷模型可以明顯降低大鼠術(shù)后12h、24h、48h BBB評分，且缺血90min、120min再灌注可導(dǎo)致大鼠BBB評分降低更為明顯，脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元大量死亡，說明改良的脊髓缺血再灌注損傷模型是一種科學(xué)可靠的動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

盡管改進(jìn)外科手術(shù)技術(shù)和應(yīng)用多種脊髓保護(hù)措施，SCII發(fā)生率近年來呈上升趨勢，且治療棘手。脊髓損傷程度與缺血時(shí)間密切相關(guān)，缺血時(shí)間越長，損傷程度越重，甚至進(jìn)入不可逆損傷期。因此，研究脊髓缺血損傷的防治前提是根據(jù)具體研究目的做出科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，闡明其病理機(jī)制并尋找合理的治療途徑。目前局灶性脊髓缺血模型制作的主要方法為:夾閉法、體外松解法、氣囊栓塞法和脂肪栓塞法［4］。

大量研究證實(shí)對主動(dòng)脈結(jié)扎能夠有效地模擬臨床常見的由于動(dòng)脈供血不足或障礙所造成的SCII。姚俊巖［5］等對新西蘭大白兔腎下腹主動(dòng)脈分別結(jié)扎20min、25min、30min、40min 和 60min，再灌注 48h 后出現(xiàn)截癱的發(fā)生率分別為0%、30%、80%、90%及100%，脊髓組織出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、壞死等改變，且損傷程度隨阻斷時(shí)間的延長而逐漸加重。管玉龍［6］等鉗夾降主動(dòng)脈30min后再灌注，術(shù)后3h～7d 83.3%小型豬后肢肌力下降為0～Ⅰ級，電鏡觀察到髓鞘板層結(jié)構(gòu)松解、軸索收縮。肖紅［7］等對家犬腎前及腎后腹主動(dòng)脈分別鉗夾30min、60min、90min及120min后開放腹主動(dòng)脈再灌注，結(jié)果腎前型阻斷動(dòng)物全部死亡，而腎后型阻斷動(dòng)物均存活，但無一只動(dòng)物出現(xiàn)脊髓神經(jīng)功能損傷特征性表現(xiàn)。主動(dòng)脈阻斷法是指在主動(dòng)脈水平阻斷血流以減少脊髓血供，該方法較為簡單，應(yīng)用廣泛。由于胸主動(dòng)脈阻斷在致脊髓損傷的同時(shí)也可導(dǎo)致肝、腎等重要臟器的損傷，降低動(dòng)物存活率。為了避免或減輕重要臟器的損傷，提高動(dòng)物存活率，本實(shí)驗(yàn)采用腎下腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)阻斷腰段脊髓血液供應(yīng)，建立脊髓缺血再灌注損傷模型。單純阻斷腎下腹主動(dòng)脈 60min、90min、120min再灌注48h，所有大鼠均存活，后肢活動(dòng)障礙不明顯，BBB評分于術(shù)后12h低于假手術(shù)組，隨后逐漸回升，并于48h恢復(fù)到18分以上，且脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元未見明顯壞死，前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量無減少?？梢?，單純阻斷大鼠腎下腹主動(dòng)脈不能完全造成腰段脊髓缺血，需要繼續(xù)改善該動(dòng)物模型。

大鼠以其繁殖力強(qiáng)、易于飼養(yǎng)、價(jià)格便宜等特點(diǎn)成為各類研究最常應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，對大鼠建立脊髓缺血再灌注損傷模型具有良好的實(shí)用價(jià)值和推廣前景。然而大鼠的解剖結(jié)構(gòu)和生理特性與其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在一定的差異。對大鼠解剖發(fā)現(xiàn)其胸腰段脊髓的血供相當(dāng)豐富，幾乎每組神經(jīng)根或每隔一組神經(jīng)根就伴有根動(dòng)脈通向脊髓前后方，阻斷腎下腹主動(dòng)脈后用亞甲藍(lán)灌注發(fā)現(xiàn)腰段脊髓被染成藍(lán)色，可見腎上腹主動(dòng)脈發(fā)出的椎動(dòng)脈可能向尾端發(fā)出側(cè)枝營養(yǎng)腰段脊髓。基于此，本實(shí)驗(yàn)采用雙極電凝切斷腎上腹主動(dòng)脈發(fā)出的椎動(dòng)脈，在最大限度地減少腰段脊髓血液代償供應(yīng)的同時(shí)不影響肝、腎等重要腹腔臟器的血液供應(yīng)，再聯(lián)合腎下腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)即可實(shí)現(xiàn)對腰段脊髓血供的有效阻斷。

本研究中，改良(E、F、G)組術(shù)后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB評分均顯著低于對照(B、C、D)組和假手術(shù)組，以F、G組降低最為明顯，且該兩組動(dòng)物出現(xiàn)排便障礙，脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元大量壞死，前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量明顯低于其它各組?？梢?，改良的脊髓缺血再灌注損傷模型阻斷90min以上能夠有效阻斷大鼠脊髓腰段血液供應(yīng)，導(dǎo)致大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙及脊髓病理組織結(jié)構(gòu)改變，是研究脊髓缺血損傷和再生修復(fù)機(jī)制的理想模型。

因此，電凝腎上腹主動(dòng)脈發(fā)出椎動(dòng)脈聯(lián)合結(jié)扎腎下腹主動(dòng)脈可有效阻斷腰段脊髓血液供應(yīng)，且脊髓常溫下耐受缺血時(shí)限為90min。改良模型是一種科學(xué)可靠的脊髓缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，可以在脊髓損傷保護(hù)研究中推廣應(yīng)用。

［1］Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.Descending systems contributing to locomotor recovery aftermild ormoderate spinal cord injury in rats:experimental evidence and a review of literature［J］.Restor Neurol Neurosci，2002，20(5):189-218.

［2］Tuttle-Newhall JE，Collins BH，Desai DM，etal.The current status of living donor liver transplantation［J］.Curr Probl Surg，2005，42(3):144-183.

［3］Marsman WA，Wiesner RH，Rodriguez L，etal.Use of fatty donor liver is associated with diminished early patient and graft survival［J］.Transplantation，1996，62(9):1246-1251.

［4］張靜萍，高旭光.局灶性脊髓缺血模型研究現(xiàn)狀［J］.中國脊柱脊髓雜志，1997，7(3):134-135.

［5］姚俊巖，翁 浩，張 蘭，等.脊髓缺血再灌注損傷模型的改進(jìn)及脊髓耐受缺血時(shí)限的研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，38(3):497-500.

［6］管玉龍，劉 鋒，董培青，等.脊髓缺血損傷動(dòng)物模型的建立［J］.中國體外循環(huán)雜志，2006，4(1):46-48.

［7］肖 紅，張 蘭，王泉云，等.經(jīng)腹主動(dòng)脈阻斷致犬脊髓缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶接懀跩］.四川醫(yī)學(xué)，2007，28(12):1309-1311.