雪荔組方水提醇沉液的HPLC指紋圖譜研究*

胡巍，陳明磊，方蕓??

雪荔組方水提醇沉液的HPLC指紋圖譜研究*

胡巍1，陳明磊2，方蕓1??

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院臨床藥學(xué)室，南京210008；2南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210046

采用HPLC建立雪荔組方的指紋圖譜，以Agilent HC-C18柱，乙腈-冰醋酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8m L·m in-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm。根據(jù)10批供試品指紋圖譜，確定了14個(gè)共有峰，相似度均大于0.95。

雪荔組方；指紋圖譜；高效液相色譜法

雪荔組方由荔枝草、車(chē)前草、六月雪、紫花地丁等4味中藥組成，具有清熱解毒、利尿消腫等功效，臨床常用于治療尿路感染[1]。組方中藥含有黃酮、環(huán)烯醚萜苷等多種化學(xué)成分?，F(xiàn)代研究證明，荔枝草等具有顯著的抑菌[2]、抗炎[3]等作用?，F(xiàn)采用指紋圖譜技術(shù)用于雪荔組方的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、Agilent chemstation工作站（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 試藥

高車(chē)前苷對(duì)照品（純度＞98%，批號(hào)：20120128，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

荔枝草等中藥材購(gòu)自南京中藥飲片廠，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定：荔枝草為唇形科植物荔枝草（Salvia plebeia R.Br）的全草；車(chē)前草為車(chē)前科植物車(chē)前（Plantago asiatica L.）的全草；六月雪為茜草科植物六月雪[Serissa serissoides（DC.）Druce]的全株；紫花地丁為堇菜科植物光瓣堇菜（Vida philippice Cav.）的全草。

10批雪荔組方水提醇沉液為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

按質(zhì)量比2∶2∶2∶1稱取荔枝草、車(chē)前草、六月雪、

紫花地丁共100 g，加入10倍量水加熱回流提取2次，每次2 h，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.01的清液，加入乙醇使含醇量達(dá)60%，靜置72 h，濃縮濾液并準(zhǔn)確定容至200mL，配制成質(zhì)量濃度為0.5 g· mL-1的水提醇沉液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取高車(chē)前苷20.2mg，置于100mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成濃度為0.202 g·L-1對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent HC-C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.5%（V/V）冰醋酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～10min，10%～15%B；10～18 min，15%～18%B；18～25 min，18%～20%B；25～30 min，20%～22%B；30～40 min，22%～40%B；40～55 min，40%～60%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm；柱溫為30℃；流速為0.8mL·min-1。

2.4 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)取同一份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以高車(chē)前苷色譜峰（圖1～2中第12號(hào)峰）作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.06%～0.23%之間，相對(duì)峰面積RSD在0.90%～2.94%之間，均小于3%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h取樣，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以高車(chē)前苷色譜峰（圖1～2中第12號(hào)峰）作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.97%～1.03%之間，相對(duì)峰面積的RSD在1.32%～2.86%之間，均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以高車(chē)前苷色譜峰（圖1～2中第12號(hào)峰）作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，供試品各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.46%～1.40%之間；相對(duì)峰面積的RSD在1.34%～2.64%之間，表明供試品溶液制備方法的重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜結(jié)果及分析

2.5.1 雪荔組方水提醇沉液指紋圖譜的建立取不同批號(hào)的藥材，配制10份雪荔組方，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20μL進(jìn)樣，將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”軟件，匹配時(shí)間漂移值設(shè)為0.2，并自動(dòng)匹配，生成對(duì)照譜圖（R）及供試品的指紋圖譜，見(jiàn)圖1、圖2。

圖2 10批供試品溶液的對(duì)照譜圖

圖3 高車(chē)前苷對(duì)照品溶液色譜圖

2.5.2 雪荔組方水提醇沉液指紋圖譜技術(shù)參數(shù)通過(guò)對(duì)10批供試品溶液色譜圖的分析，最終確定共有峰14個(gè)。高車(chē)前苷為主要成分之一，將其對(duì)照品溶液按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，與供試品溶液色譜圖進(jìn)行比對(duì)，相對(duì)保留時(shí)間一致的峰為12號(hào)峰（見(jiàn)圖3），故選擇其作為參照峰（S），設(shè)定其保留時(shí)間和峰面積值均為1.0，計(jì)算余下各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，見(jiàn)表1、表2。經(jīng)計(jì)算，10批供試品中高車(chē)前苷含量分別為0.821、0.823、0.818、0.835、0.806、0.829、0.831、0.816、0.826、0.822 mg·g-1，平均含量為0.822mg·g-1，RSD為1.01%。

表1 共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

2.5.3 相似度分析用“中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”軟件對(duì)10批供試品溶液的色譜圖進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果10批供試品溶液與生成的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，相似度均大于0.95，見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用DAD檢測(cè)器對(duì)190～400 nm波段進(jìn)行掃描并采集三維掃描圖，綜合考慮設(shè)定波長(zhǎng)內(nèi)峰的數(shù)目、色譜峰的分離情況，最終選擇335 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 共有峰的相對(duì)峰面積

表3 10批供試品圖譜的相似度結(jié)果

3.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)先后考察了甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水、乙腈-水-冰醋酸等多種流動(dòng)相體系，比較發(fā)現(xiàn)使用甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸作為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離效果較差，而使用乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)分離度較好；此外，在流動(dòng)相體系中加入冰醋酸有利于得到更好的峰形，考察了加入不同比例的冰醋酸，通過(guò)比較得出加入0.5%（V/V）的冰醋酸時(shí)效果最好。

4 小結(jié)

通過(guò)測(cè)定10批雪荔組方水提醇沉液的HPLC圖譜，共標(biāo)出14個(gè)共有峰，各批次間的相似度均較好，為組方提取工藝中間體的質(zhì)量控制提供有效的理論依據(jù)。同時(shí)由于指紋圖譜中只有高車(chē)前苷這一成分是可知的，譜圖中其他成分還有待進(jìn)一步深入研究，以保證指紋圖譜的全面性[2]。

[1]Peng MM,Fang Y,Hu W,et al.The pharmacological activities of Compound Salvia Plebeia Granules on treating urinary tract infection[J].J Ethnopharmacol, 2010,129(1):59-63.

[2]馬瑜紅，李玲，歐陽(yáng)靜萍，等.荔枝草抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（9）：2209-10.

[3]童延清，李暉.紫花地丁、蒲公英體外抗菌作用研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2003，23（9）：669.

Study on the HPLC Fingerprints of Com pound Xueli*

HU Wei1,CHEN Ming-lei2,FANG Yun1**1Department of Clinical Pharmacy,the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008;2Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210046,China

HPLC fingerprints of Compound Xueli were established to provide an effective method of its quality control.An Agilent HC-C18column was used with acetonitrile-glacial acetic acid as the mobile phase for gradient elution;the flow rate was at 0.8mL·min-1;and the detection wavelength was at 335 nm.A total of 14 common peaks were identified and the similarities among different batches were all greater than 0.95.

Compound Xueli;Fingerprint;HPLC

R927

A

1673-7806（2012）05-476-03

江蘇省中醫(yī)藥局管理項(xiàng)目（HZ1016KY）

胡巍，女，藥師E-mail:huwei-82@163.com

**通訊作者方蕓，女，主任藥師Tel:025-83105660

2012-08-01

2012-08-23