鹽度和溫度對大菱鲆幼魚抗氧化酶活性的影響

郭黎，馬愛軍，王新安，黃智慧，于宏，楊志

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室，山東青島266071;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306;3.煙臺開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司，山東煙臺264003)

大菱鲆Scophthalmus maximus是原產(chǎn)于歐洲的著名海水養(yǎng)殖品種，具有生長迅速、肉味鮮美、耐低氧、食物轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點［1-2］。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所于1992年“跨洋引種”將其引入中國，1999年突破了大規(guī)模育苗的關(guān)鍵技術(shù)。目前，大菱鲆已成為中國北方地區(qū)主要養(yǎng)殖品種［3-4］之一，但養(yǎng)殖環(huán)境條件的局限性影響了大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模推廣。溫度和鹽度作為兩個主要的環(huán)境因子，在魚類生長繁育過程中起著非常重要的作用，為此，開展大菱鲆溫度和鹽度脅迫的研究，對其良種選育和疾病防治具有重要的意義。

養(yǎng)殖密度、光照［5］、水溫［6］、溶解氧［7］、鹽度［8］等環(huán)境條件的變化直接影響魚體內(nèi)活性氧含量及抗氧化酶的活性，使機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)以適應(yīng)外界環(huán)境的改變，但若長期處于應(yīng)激狀態(tài)，必然導(dǎo)致魚體免疫防御能力和抗病力下降，影響幼魚正常生長［9］。由于抗氧化酶具有消除機體氧自由基的功能，對增強吞噬細胞防御能力和機體免疫功能有重要作用［10］。因此，研究魚體抗氧化酶活力對了解并提高機體的免疫機能具有重要意義。當(dāng)前大菱鲆養(yǎng)殖模式很容易受到如地下水資源量的局限、海水水質(zhì)的下降、地下海水溫度的升高以及不同地區(qū)地下水鹽度的不同等影響［11］。本研究中，作者以大菱鲆幼魚為研究對象，初步研究了溫度和鹽度交互作用對大菱鲆幼魚行為活動、攝食、存活情況以及體表黏液、血液、鰓和肝臟抗氧化酶活力的影響，以期為大菱鲆幼魚耐溫、耐鹽選育，養(yǎng)殖推廣，以及病害防治工作提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用大菱鲆幼魚飼養(yǎng)于煙臺市天源水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，個體質(zhì)量為 (80.6±6.3)g，均為人工繁育的健康幼魚。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗設(shè)置5個溫度水平:17、20、23、25、28℃，設(shè)置5個鹽度水平:5、10、20、30、40，溫度和鹽度共25個組合，每個組合分別設(shè)置3個重復(fù)。試驗在玻璃水槽中進行，每個水槽盛海水約300 L，放養(yǎng)30尾魚。

試驗魚在玻璃水槽中暫養(yǎng)一周后開始試驗，暫養(yǎng)與試驗期間，每天9:00投喂餌料，持續(xù)充氣，每天換水1次。海水正常鹽度為30，低鹽度海水由地下海水與淡水配制而成，高鹽度海水由地下海水與海水晶配制而成。從常溫 (13℃)開始24 h升到17℃，然后以每16 h升高1℃的速度升高至試驗設(shè)定水溫。采用靜水法充氣培養(yǎng)，用自動恒溫加熱器控溫，觀察試驗魚在各鹽度中的高溫脅迫行為及死亡情況。

1.2.2 樣品的制備 達到設(shè)定溫度48 h后，從每個水槽中隨機取3尾魚，用一次性注射器 (2.5 μL)從大菱鲆幼魚尾靜脈取血，血液置于1.5 mL離心管中，4℃下靜置4 h后，以12 000 r/min離心30 min，取上清液，即為血清樣品;用蒸餾水清洗大菱鲆幼魚體表，用一次性塑料吸管 (3 μL)輕輕刮取魚體表面黏液，置于1.5 mL離心管中，即為黏液樣品;剪取魚鰓絲和肝臟，用預(yù)冷蒸餾水洗凈，濾紙吸干，置于1.5 mL離心管中，即為鰓絲和肝臟樣品。所取樣品均置于冰箱 (-20℃)中以備用。

1.2.3 酶液的制備 血清樣品直接進行酶活測定;取黏液樣品與 PBS(包含 NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.42g， KH2PO40.27g， pH 7.4)以1∶2的體積混合，充分震蕩，用高速冷凍離心機在4℃下以12 000 r/min離心30 min，取上清液測定酶活;取肝臟和鰓絲樣品，每克組織加9倍體積的生理鹽水 (體積分數(shù)為0.86%)，用玻璃勻漿器冰浴勻漿，再將勻漿液在4℃下以12 000 r/min離心30 min，取上清液測定酶活。

1.2.4 酶活的測定 由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司采用通過精煉的Brodford方法測定樣品的總蛋白含量;使用試劑盒 (購自南京建成生物工程研究所)測定樣品的超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶 (GPX)，測定步驟按試劑盒說明書進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，用Duncan氏法進行多重比較。試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差(mean±S.D.)表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度和鹽度下大菱鲆幼魚的攝食和死亡情況

從表1可見:鹽度對大菱鲆幼魚的攝食及存活有一定的影響，在溫度為17℃和20℃的條件下，大菱鲆能夠在低鹽和高鹽的環(huán)境中存活并保持較好的食性，且鹽度為40時大菱鲆的攝食和存活情況比鹽度為5時好。在鹽度為20和30的條件下，大菱鲆能夠耐受28℃的水溫并保持較低的死亡率;在鹽度為5和40的條件下，溫度為23℃時大菱鲆攝食變差并開始死亡，28℃時開始大量死亡。根據(jù)死亡情況來判斷，大菱鲆在高鹽和低鹽條件下對高溫的耐受力，要比在適宜鹽度條件下約低5℃。通過觀察大菱鲆幼魚的攝食以及死亡情況，發(fā)現(xiàn)在溫度為17、20℃與鹽度為20、30的組合條件下，大菱鲆幼魚的攝食、存活情況要顯著好于高溫和低鹽、高溫和高鹽組合 (P＜0.05)。

2.2 抗氧化酶活性的測定

2.2.1 大菱鲆幼魚肝臟中抗氧化酶的活性 由方差分析可知，溫度、鹽度以及溫度與鹽度的交互作用，對大菱鲆幼魚肝臟SOD、CAT、GP-X活力影響均顯著 (P＜0.05)。從表2可見:當(dāng)溫度一定時，大菱鲆幼魚肝臟的SOD、CAT、GP-X活力在其他各鹽度中時均高于在對照組鹽度30時，且在鹽度為5時均較高。當(dāng)鹽度一定時，肝臟的SOD與GP-X活力受溫度變化的影響沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，SOD活力在17℃時最高，且顯著高于其他各組 (P＜0.05)，在20℃時較低;CAT活力隨著溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，在23℃時最高 (除鹽度為30組外)，且顯著高于其他各組(P＜0.05);GP-X活力在20℃和28℃時較高，而在17℃時最低，且顯著低于其他各組 (P＜0.05)。

在溫度與鹽度交互作用條件下，SOD活力在17℃與鹽度為5和40的組合中較高;在20℃、鹽度為5的組合中最低;CAT活力在23℃、鹽度為5和10的組合中較高，在17℃、鹽度為30及28℃、鹽度為30的組合中較低;GP-X活力在28℃、鹽度為5及20℃、鹽度為10的組合中較高，在17℃所對應(yīng)的各鹽度組合中活力均較低。

2.2.2 大菱鲆幼魚鰓中抗氧化酶的活性 由方差分析可知，溫度、鹽度以及溫度和鹽度的交互作用，對大菱鲆幼魚鰓中SOD、CAT、GP-X活力影響均顯著 (P＜0.05)。從表3可見:當(dāng)溫度一定時，鰓中SOD、CAT、GP-X活力在鹽度為30時相對偏低。當(dāng)鹽度一定時，鰓中SOD活力變化波動較大，20℃組均顯著高于其他各組 (P＜0.05);CAT活力沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性變化，僅在17℃時活力最低;而GP-X活力在17℃時最高，且

顯著高于其他各組 (P＜0.05)。

表1 大菱鲆幼魚在不同溫度和鹽度下的攝食情況以及死亡數(shù)Tab.1 The ingestion and mortality of juvenile turbot under different temperature and salinity

表2 不同溫度和鹽度下大菱鲆幼魚肝臟中SOD、CAT、GP-X活力的測定結(jié)果Tab.2 Activities of SOD，CAT and GP-X in the liver of juvenile turbot under different temperature and salinity U/mg

表3 不同溫度和鹽度下大菱鲆幼魚鰓中SOD、CAT、GP-X活力的測定結(jié)果Tab.3 Activities of SOD，CAT and GP-X in the gills of juvenile turbot under different temperature and salinity U/mg

在溫度與鹽度交互作用的條件下，鰓中SOD活力在20℃、鹽度為20的組合中最高，在23℃、鹽度為30的組合中最低;CAT活力在28℃、鹽度為30的組合中最高，在17℃、鹽度為30的組合中最低;GP-X活力在17℃、鹽度為5的組合中最高，在28℃、鹽度為20的組合中最低。

2.2.3 大菱鲆幼魚血清中抗氧化酶的活性 由方差分析可知，溫度、鹽度以及溫度和鹽度的交互作用，對大菱鲆幼魚血清中SOD、CAT、GP-X活力影響均顯著 (P＜0.05)。從表4可見:當(dāng)溫度一定時，大菱鲆幼魚血清中SOD活力隨著鹽度的升高呈先升高后降低再升高的趨勢，在鹽度為5時較低;CAT活力在鹽度為5時最高，在鹽度為30時較低;而GP-X活力受鹽度變化的影響沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律。鹽度一定時，血清中SOD活力在17℃時較高，在28℃時較低;CAT活力隨著溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，在25℃時最高，28℃時較低;GP-X活力隨著溫度的升高基本呈現(xiàn)出先降低后升高再降低再升高的折線變化趨勢，在23℃與28℃時較高，在20℃時較低。

在溫度與鹽度交互作用的條件下，血清中SOD活力在28℃、鹽度為30的組合中最高，在28℃、鹽度為5的組合中最低;CAT活力在25℃、鹽度為5的組合中最高，在28℃、鹽度為40的組合中最低;GP-X活力在23℃、鹽度為40，28℃、鹽度為5，28℃、鹽度為40的組合中較高，在17℃、鹽度為30的組合中最低。

2.2.4 大菱鲆幼魚黏液中抗氧化酶的活性 由方差分析可知，溫度、鹽度以及溫度和鹽度的交互作用，對大菱鲆幼魚黏液中SOD、CAT活力影響均顯著 (P＜0.05)。從表5可見:溫度一定時，黏液中SOD的活力隨著鹽度的變化沒有明顯的規(guī)律性，在鹽度為40時相對偏高;CAT活力在鹽度為30時最低，且隨著鹽度由30起降低或升高而均升高，在鹽度為5時最高，且顯著高于其他各組 (P＜0.05)。鹽度一定時，黏液中SOD、CAT活力沒有明顯的變化規(guī)律。

在溫度與鹽度交互作用的條件下，SOD活力在20℃、鹽度為40時最高，在28℃、鹽度為10和30的組合中活力較低;CAT活力在23℃、鹽度為5的組合中最高，在28℃、鹽度為30的組合中最低。

通過計算得到的GP-X值基本為負值，分析原因可能是黏液中GP-X的活力太低，難以檢測出。

表4 不同溫度和鹽度下大菱鲆幼魚血清中SOD、CAT、GP-X活力的測定結(jié)果Tab.4 Activities of SOD，CAT and GP-X in the serum of juvenile turbot under different temperature and salinity U/mL

表5 不同溫度和鹽度下大菱鲆幼魚黏液中SOD、CAT活力的測定結(jié)果Tab.5 Activities of SOD and CAT in the mucus of juvenile turbot under different temperature and salinity U/mg

3 討論

3.1 溫度和鹽度對大菱鲆幼魚攝食行為、活動狀況以及存活情況的影響

鹽度發(fā)生變化時，魚類必然要經(jīng)歷滲透調(diào)節(jié)等一系列過程，這需要消耗大量的能量，從而加速了體內(nèi)新陳代謝，增大了魚體的能量消耗［12］。溫度主要對魚類代謝反應(yīng)速率起控制作用，從而影響魚類的活動和生長。溫度的升高可以導(dǎo)致機體耗氧量的增加，增大魚體的能量消耗［9，13］。如果長期處于高溫低鹽或者高溫高鹽狀態(tài)，必將導(dǎo)致魚體能量收支失衡，使魚體抵抗力下降，容易引起死亡。本試驗結(jié)果表明，在溶解氧充足的情況下，大菱鲆幼魚在鹽度為20～30的海水中可以耐受28℃的水溫而保持較低的死亡率;當(dāng)水溫不超過20℃時，大菱鲆幼魚可以長時間耐受鹽度為5和40的海水;4種組合 (水溫為17、20℃與鹽度為20、30)條件下，大菱鲆幼魚的攝食、存活情況要顯著好于其他組合 (P＜0.05)。

3.2 溫度與鹽度對大菱鲆幼魚抗氧化酶活性的影響

在魚類抗氧化系統(tǒng)中，SOD、CAT以及GP-X對清除氧化脅迫過程中產(chǎn)生的活性氧自由基起著決定性作用［14-15］。脊椎動物的肝臟是新陳代謝和氧氣消耗的主要組織，其中的抗氧化酶活力較高［16］，肝臟中SOD的變化最能代表機體抗氧化防御的變化特征［17］。本試驗中發(fā)現(xiàn)，肝臟中的SOD與CAT活力要高于在相同狀態(tài)下的血液和鰓中的活力，這與上述結(jié)論較相似。

環(huán)境條件的變化可引起魚體抗氧化酶活性的變化，當(dāng)鹽度發(fā)生變化時，魚類必然要經(jīng)歷滲透調(diào)節(jié)等一系列過程［18］。這些過程需要消耗大量的能量，從而加速了體內(nèi)新陳代謝，引發(fā)體內(nèi)抗氧化酶的積極響應(yīng)，以應(yīng)對自由基對機體的脅迫反應(yīng)。王曉杰等［19］對許氏平鲉的研究表明，許氏平鲉血液中SOD、CAT活力隨海水鹽度的降低呈逐漸上升趨勢;楊健等［20］對軍曹魚肌肉的研究也得到同樣的結(jié)果。本試驗中得到的結(jié)果與之類似，即隨著正常海水鹽度 (30)的降低或者升高，酶活力呈現(xiàn)升高的趨勢，而達到極限鹽度時，又出現(xiàn)下降趨勢。推測認為:當(dāng)鹽度改變時，大菱鲆幼魚需要消耗能量來保持機體滲透壓平衡，因此，加速了新陳代謝，產(chǎn)生了較多的活性氧自由基，從而導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化酶活力發(fā)生適應(yīng)性變化，以應(yīng)對自由基對機體的脅迫反應(yīng);而當(dāng)超過極限耐受鹽度時，機體生命表征微弱，酶活力也降低。隨著鹽度的變化，魚體不僅產(chǎn)生如酶活力等生理生化方面的應(yīng)激性變化，而且這種應(yīng)激性反應(yīng)也表現(xiàn)在基本的生命表征中，如攝食、行為活動及死亡狀況等等。因此，結(jié)合這些因素，初步判斷出大菱鲆幼魚生存鹽度為20～30，而當(dāng)?shù)陀?0或高于40時會出現(xiàn)極限反應(yīng)，甚至造成死亡。

溫度也是影響魚類抗氧化酶活性的環(huán)境因素之一，它主要對魚類代謝反應(yīng)速率起控制作用［18］。溫度的升高可以導(dǎo)致機體耗氧量的增加，促進氧自由基的產(chǎn)生，進而促進抗氧化酶活性的升高［9］。劉松巖等［21］對中華鱘的研究表明，當(dāng)溫度從12℃升高到31℃時，血清中CAT活力呈上升趨勢，但變化不顯著，而SOD活力變化顯著，在26℃時達到最高值。本試驗中大菱鲆幼魚4種組織中SOD、CAT、GP-X活力隨著溫度的升高有一定的波動性，但整體來說，其活力隨著溫度升高的變化沒有顯著的規(guī)律。本研究中通過觀察發(fā)現(xiàn)，各組織中酶活力在23～25℃時均會發(fā)生顯著的變化，這說明在此溫度點發(fā)生了應(yīng)激性的生理生化反應(yīng)，因此，同樣結(jié)合魚體的攝食、行為活動及死亡狀況等生命現(xiàn)象，大致推斷大菱鲆幼魚最適生存水溫為17～20℃。

3.3 溫度、鹽度交互作用對大菱鲆的影響

研究表明，溫度和鹽度對一些海水硬骨魚類存在交互效應(yīng)［22-25］。Imsland等［26］研究發(fā)現(xiàn)，大菱鲆生長最佳的溫度與鹽度組合為21.8℃、鹽度為18.5，以及18.3℃、鹽度為19.0。本研究中通過分析溫度和鹽度的交互效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，兩因素交互作用對SOD、CAT和GP-X活力的影響顯著，說明魚體抗氧化酶活力的變化不僅與溫度有關(guān)，還與鹽度有關(guān)。根據(jù)多重比較結(jié)果，并結(jié)合大菱鲆幼魚攝食、行為活動以及死亡狀況，初步判斷大菱鲆幼魚的適宜生活水溫為17～20℃，適宜生活鹽度為20～30，這與以上觀點較為接近，同時也與大菱鲆稚魚適宜的水溫為16～18℃，適宜的鹽度為25～32［27］的論點相吻合。

本研究結(jié)果表明，在溫度與鹽度的交互作用下，肝臟和黏液中的酶活力變化最為顯著，初步判斷這是由于肝臟是主要的新陳代謝和氧氣消耗的組織，體表黏液則是魚體與外界直接接觸的第一層屏障，最容易受到抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控，因此，本文作者認為，肝臟和體表黏液系統(tǒng)是魚體抵抗外界環(huán)境變化的主要器官。

［1］雷霽霖.英國養(yǎng)殖大菱鲆簡況［J］.水產(chǎn)科技情報，1983(2):26-27.

［2］雷霽霖.海水養(yǎng)殖新品種介紹——大菱鲆［J］.中國水產(chǎn)，2000(4):89-92.

［3］雷霽霖.大菱鲆(Scophthalmus maximus)引進與馴養(yǎng)試驗［J］.中國動物科學(xué)研究，2001(2):408-413.

［4］馬愛軍，陳四清，雷霽霖，等.大菱鲆幼魚幾種飼料的分析與對比實驗［J］.飼料工業(yè)，2000，21(7):17-19.

［5］Fitzgerald J P.Comparative analysis of superoxide dismutase activities in a range of temperate and tropical teleost fish［J］.Comp Biochem Physiol，1992，101B:111-114.

［6］Stephan G，Guillaume J，Lamour F.Lipids peroxidation in turbot(Scophthalmus maximus)tissue:effect of dietary vitamin E and dietary n-6 or n-3 polyunsaturated fatty acids［J］.Aquaculture，1995，130:251-268.

［7］Parihar M S，Dubey A K.Lipid peroxidation and ascorbic acid status in respiratory organs of male and female freshwater catfish Heteropneustes fossilis exposed to temperature increase［J］.Comp Biochem Physiol，1995，112C:309-313.

［8］Helene R，Grard B.Fish blood parameters as a potential tool for i-dentification of stress caused by environmental factors and chemical intoxication［J］.Mar Environ Res，1996，41(1):27-43.

［9］Martínez-Alvarez R M，Morales A E，Sanz A.Antioxidant defenses in fish:Biotic and abiotic factors［J］.Reviews in Fish Biology and Fisheries，2005，15:75-88.

［10］Rudneva I I.Blood antioxidant system of Black Sea elasmobranch and teleost［J］.Comp Biochem Physiol，1997，118C:255-260.

［11］黃連光，蘇瑜.大菱鲆工廠化循環(huán)式節(jié)水養(yǎng)殖技術(shù)［J］.養(yǎng)殖與飼料，2011(5):17-18.

［12］Martínez-Alvarez R M，Hidalgo M C，Domezain A，et al.Physiological changes of sturgeon Acipenser naccarii caused by increasing environmental salinity［J］.J Experim Biol，2002，205:3699-3702.

［13］Lushchak V I，Bagnyukova T V.Temperature increase results in oxidative stress in goldfish tissues:1.Indices of oxidative stress［J］.Comp Biochem Physiol，2006，143C:30-35.

［14］Boeuf G，Payan P.How should salinity influence fish growth［J］.Comp Biochem and Physiol，2001，130C:411-423.

［15］Ansaldo M，Luquet C M，Evelson P A，et al.Antioxidant levels from different Antarctic fish caught around south［J］.Polar Biology，2000，23(3):160-165.

［16］Otto D M E，Moon T W.Endogenous antioxidant systems of two teleost fish.the rainbow trout and the black bullhead，and the effect of age［J］.Fish Physiol Biochem，1996，15(4):349-358.

［17］Wilhelm-Filho D W，Giulivi C，Boveris A.Antioxidant defenses in marine fish I:Teleosts［J］.Comp Biochem Physiol，1993，106C:409-413.

［18］柳學(xué)周，徐永江，馬愛軍，等.溫度、鹽度、光照對半滑舌鰨胚胎發(fā)育的影響及孵化條件調(diào)控技術(shù)研究［J］.海洋水產(chǎn)研究，2004，25(6):1-8.

［19］王曉杰，張秀梅，李文濤.鹽度脅迫對許氏平鲉血液免疫酶活力的影響［J］.海洋水產(chǎn)研究，2005，26(6):137-142.

［20］楊健，陳剛，黃建盛.溫度和鹽度對軍曹魚幼魚生長與抗氧化酶活性的影響［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2007，27(4):25-29.

［21］劉松巖，王明學(xué).環(huán)境脅迫對中華鱘體內(nèi)自由基水平和抗氧化酶活力的影響［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［22］Watanabe T.Importance of docosahexaenoic acid in marine larval fish［J］.World Aqua Soc，1993，24:152-161.

［23］Peters D S，Boyd M T.The effect of temperature，salinity，and availability of food on the feeding and growth of the hogchoker，Trinectes maculates(Bloch and Schneider)［J］.J Exp Mar Biol Ecol，1972，7:201-207.

［24］Malloy K D，Targett T E.Feeding，growth and survival of juvenile summer flounder Paralichthys dentatus，experimental analysis of the effects of temperature and salinity［J］.Mar Ecol Prog Ser，1991，72:213-223.

［25］Likongwe J S，Steeko T D，Stauffer Jr J R，et al.Combined effects of water temperature and salinity on growth and feed utilization of juvenile Nile tilapia Oreochromis niloticus(Linneus)［J］.Aquaculture，1996，146:37-46.

［26］Imsland A K，F(xiàn)oss A，Gunnarsson S，et al.The interaction of temperature and salinity on growth and food conversion in juvenile turbot(Scophthalmus maximus)［J］.Aquaculture，2001，198:353-367.

［27］雷霽霖，門強.大菱鲆人工繁殖與養(yǎng)殖技術(shù)講座［J］.齊魯漁業(yè)，2002，19(10):47-48.