鯉45S rDNA的染色體熒光原位雜交定位

趙紫霞，鄧海霞，徐鵬，張研，李炯棠，孫效文

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心，北京100141;2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023)

鯉Cyprinus carpio是世界上養(yǎng)殖范圍較廣的經(jīng)濟(jì)魚類，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)著非常重要的地位。近年來(lái)，隨著鯉基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究的逐步深入［1］，已測(cè)定了大量的功能基因序列、分子標(biāo)記序列、表達(dá)序列標(biāo)簽等數(shù)據(jù)，并構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜［2］、細(xì)菌人工染色體物理圖譜［3］等，然而這些基因組序列在鯉染色體上的定位信息卻少見報(bào)道。目前，僅有5S核糖體DNA(ribosomal DNA，rDNA)［4］、重復(fù)序列 CR1［5］和生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)基因片段［6］等得到定位。

45S rDNA編碼的3種核糖體RNA參與蛋白質(zhì)的合成，是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量最為豐富的基因［7］，也是基因組內(nèi)典型的中度串聯(lián)重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)單元由18S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer-1，ITS-1)、5.8S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(internal transcribed spacer-2，ITS-2)和28S rDNA組成，重復(fù)單元之間被非轉(zhuǎn)錄基因間隔區(qū) (Intergenicspacer， IGS) 所 分 隔［8-9］。45S rDNA存在于所有真核生物中，拷貝數(shù)通常為數(shù)百個(gè)，不同物種間45S rDNA的染色體分布具有較大差異，因而其常被作為物種 (或品種)重要的遺傳學(xué)特征進(jìn)行研究。目前，有多個(gè)水產(chǎn)物種的45S rDNA定位信息已有報(bào)道，如櫛孔扇貝Chlamys farreri［10］、泥鰍 Misgurnus anguillicaudatus［11］、多瑙哲羅鮭Hucho hucho［12］等。本研究中，作者通過(guò)熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)，對(duì)鯉45S rDNA序列進(jìn)行染色體定位。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所松浦實(shí)驗(yàn)基地，包括1齡散鱗鏡鯉Cyprinus carpio var.scattered mirror 5尾，1齡松浦鯉Cyprinus carpio Songpu 5尾，體長(zhǎng)為14.7～19.2 cm，體質(zhì)量為42～106 g。

1.2 方法

1.2.1 有絲分裂中期染色體的制備 試驗(yàn)魚在25℃恒溫水族箱內(nèi)暫養(yǎng)48 h后，腹腔注射植物血凝素(上海世澤生物科技有限公司)，劑量為60 μg/g(魚體質(zhì)量)。18 h后腹腔注射秋水仙素(Sigma-Aldrich)，劑量為6 μg/g(魚體質(zhì)量)。2 h后剪尾鰭放血，取腎組織，采用空氣干燥法［13］制備有絲分裂中期染色體，置于冰箱(-80℃)中保存。

1.2.2 鯉45S rDNA序列的獲取與驗(yàn)證 使用CLC Genomics Workbench 4.03數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，依據(jù)人45S rDNA內(nèi)的相對(duì)保守區(qū)域18S rDNA(NCBI Reference Sequence:NR_003286.2，下同)、5.8S rDNA(NR_003285.2)、28S rDNA(NR_003287.2)，在本課題組鯉基因組序列草圖數(shù)據(jù)庫(kù)中采用Blast軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)，對(duì)于命中的序列群進(jìn)行必要的重新拼接和篩選，獲得鯉45S rDNA完整序列。在該序列上設(shè)計(jì)引物 (由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，分別以散鱗鏡鯉和松浦鯉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，委托中美泰和生物技術(shù) (北京)有限公司測(cè)序驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性。

1.2.3 染色體熒光原位的雜交 分別使用引物CAAG1191、CAAG3602和 CAAG1845，采用 PCR標(biāo)記探針合成試劑盒 (Roche公司產(chǎn)品)制備生物素標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針，雜交液成分為:5 ng/μL(探 針)，15 ng/μL 鮭 精 DNA(Sigma-Aldrich)，15 ng/μL 大腸桿菌 tRNA(Roche)，2 μg/μL小牛血清白蛋白(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，10%硫酸葡聚糖(Amresco)和4×SSC。按照文獻(xiàn) ［11］中的方法進(jìn)行雜交反應(yīng)。

1.2.4 熒光染色及信號(hào)的放大 對(duì)于用生物素標(biāo)記的探針雜交片，依次加入用綠色熒光染料FITC標(biāo)記的親和素 (Sigma-Aldrich)、用生物素標(biāo)記的親和素抗體 (Vector)、用FITC標(biāo)記的親和素進(jìn)行反應(yīng);對(duì)于用地高辛標(biāo)記的探針雜交片，依次加入鼠抗地高辛抗體 (Sigma-Aldrich)、用紅色熒光染料TRITC標(biāo)記的兔抗鼠抗體 (Sigma-Aldrich)、用TRITC標(biāo)記的羊抗兔抗體 (Sigma-Aldrich)進(jìn)行反應(yīng)，使用各產(chǎn)品說(shuō)明書推薦劑量。每次在37℃下避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后按文獻(xiàn) ［10］中的方法洗去未結(jié)合的試劑。

1.2.5 雜交信號(hào)的熒光觀察 每張載玻片上滴加50 μL 含有5 ng/μL DAPI、20 mg/mL DABCO、100 mmol/L Tris(pH 8.0)、90%甘油的熒光染色劑，室溫下放置3 min后蓋片，用甲油封片，在4℃下染色8 h后，在Imager M2熒光顯微鏡 (Zeiss)下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 45S rDNA序列及其驗(yàn)證

獲得的序列全長(zhǎng)9 426 bp，其中包含45S rDNA完整序列和非轉(zhuǎn)錄IGS的部分序列，其功能注釋見表1，序列信息已提交 GenBank，注冊(cè)號(hào)為JN628435。

由于該序列是從鯉全基因組高通量二代測(cè)序的初步組裝結(jié)果中獲取，有可能存在拼接錯(cuò)誤，因此在該序列不同位置處設(shè)計(jì)引物，分別以散鱗鏡鯉和松浦鯉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證序列信息的準(zhǔn)確性。設(shè)計(jì)的13對(duì)引物基本均勻覆蓋該序列的大部分區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果均呈現(xiàn)清晰單帶 (圖1)，實(shí)際擴(kuò)增長(zhǎng)度與預(yù)期相符，證明該序列組裝結(jié)果較為可靠。

表1 鯉基因組序列JN628435功能注釋Tab.1 Functional annotation of common carp genome sequence JN628435

為進(jìn)一步驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性，在以散鱗鏡鯉基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中選取10條進(jìn)行TA克隆，挑取單克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與組裝序列的一致性均在95%以上，可轉(zhuǎn)錄區(qū)的一致性為99%或100%。擴(kuò)增引物詳細(xì)信息和目標(biāo)片段測(cè)序結(jié)果見表2。

2.2 散鱗鏡鯉和松浦鯉有絲分裂中期染色體組型

選取形態(tài)清晰、染色體分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示兩個(gè)品種鯉的染色體二倍數(shù)均為2n=100。散鱗鏡鯉共計(jì)數(shù)52個(gè)分裂相，其中37個(gè)分裂相染色體數(shù)目為100，其典型形態(tài)如圖2-A所示，多數(shù)染色體數(shù)目完整的分裂相核型公式符合張克儉等［14］報(bào)道的公式20m+26sm+30st+24t;松浦鯉共計(jì)數(shù)46個(gè)分裂相，其中38個(gè)分裂相染色體數(shù)目為100，其典型形態(tài)如圖2-B所示，多數(shù)染色體數(shù)目完整的分裂相核型公式符合尹洪濱［15］報(bào)道的公式30m+26sm+26st+18t。

2.3 標(biāo)記探針的制備

圖1 用于驗(yàn)證序列準(zhǔn)確性的引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of the primers used in sequence accuracy verification

表2 用于驗(yàn)證序列準(zhǔn)確性的引物信息及測(cè)序結(jié)果Tab.2 Primer information and sequencing of the primers used in sequence accuracy verification

選擇位于JN628435序列上不同區(qū)域的3對(duì)引物，以PCR方法制備用于雜交反應(yīng)的標(biāo)記探針，其中探針CAAG1191和CAAG3602使用生物素標(biāo)記，探針CAAG1845使用地高辛標(biāo)記。探針的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3，與未進(jìn)行標(biāo)記的普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相比，標(biāo)記后探針的電泳條帶有微弱滯后，表明其標(biāo)記成功，分子量增加，泳動(dòng)速度下降。

2.4 通過(guò)單色FISH進(jìn)行探針的染色體定位

使用綠色熒光染料FITC對(duì)生物素標(biāo)記進(jìn)行顯色和信號(hào)放大，顯微鏡照片顯示，5.8S rDNA探針CAAG1191和IGS探針CAAG3602(圖4)在散鱗鏡鯉和松浦鯉中的定位情況相同，僅定位于一對(duì)近端著絲粒染色體的短臂末端。

2.5 通過(guò)雙色FISH進(jìn)行探針的染色體共定位

將用地高辛標(biāo)記的18S rDNA探針CAAG1845與用生物素標(biāo)記的5.8S rDNA探針CAAG1191和IGS探針CAAG3602在染色體上共定位，使用紅色熒光染料TRITC對(duì)用地高辛標(biāo)記的進(jìn)行顯色和信號(hào)放大，使用綠色熒光染料FITC對(duì)用生物素標(biāo)記的進(jìn)行顯色和信號(hào)放大，顯微鏡照片 (圖5)顯示，位于45S rDNA不同區(qū)域的3條探針在散鱗鏡鯉和松浦鯉中均定位于同一對(duì)近端著絲粒染色體的短臂末端。圖5-A、C顯示探針CAAG1845的單獨(dú)定位結(jié)果 (紅色)，圖5-B、D顯示3條探針共定位的結(jié)果，其中黃色信號(hào)由紅色的TRITC和綠色的FITC混合而成。

3 討論

3.1 45S rDNA探針的設(shè)計(jì)

國(guó)內(nèi)報(bào)道的核糖體DNA定位研究多使用包含部分目的片段的質(zhì)?？寺∽魈结槪?，11］，通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)室之間相互饋贈(zèng)而獲得。由于探針獲取途徑受限，一定程度上影響了FISH技術(shù)的推廣。本研究中利用“鯉魚基因組計(jì)劃”的基因組測(cè)序組裝結(jié)果，獲得了鯉45S rDNA全長(zhǎng)序列，依據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR方法制備雜交探針，不同實(shí)驗(yàn)室之間只需交流引物信息即可共享探針，有效提高了FISH技術(shù)的通用性。

曾有部分物種rDNA旁系同源現(xiàn)象存在的報(bào)道［16］，即在同一物種基因組的不同區(qū)域，存在具有同性源但不完全相同的rDNA序列，有的能夠轉(zhuǎn)錄［17-19］，有的則徹底失去功能成為假基因［16，20-24］。雖然在鯉基因組序列草圖數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)的過(guò)程中尚未發(fā)現(xiàn)45S rDNA旁系同源序列，但為了確保覆蓋可能存在的旁系同源序列，本研究中設(shè)計(jì)制備位于45S rDNA不同區(qū)域的多條探針分別用于FISH定位。

探針 CAAG1191長(zhǎng)度為 116 bp，位于 5.8S rDNA上，是一段物種間高度保守的序列，其引物序列與人類5.8S rDNA(NR_003285.2)僅相差1個(gè)堿基，與斑馬魚 (CT583728.24)、巖原鯉(DQ994157.1)、四川白甲魚 (DQ994153.1)、重口裂腹魚 (DQ994148.1)等多種鯉科魚類的同源序列則完全相同，該探針可以用作鯉科魚類的通用探針。

探針CAAG1845長(zhǎng)度為1 052 bp，位于18S rDNA上，序列相對(duì)保守，其引物序列與斑馬魚(BX296557.35)、銀鯽 (EF189737.1)兩個(gè)物種能夠通用。

探針CAAG3602長(zhǎng)度為574 bp，位于非轉(zhuǎn)錄IGS區(qū)域，是一段保守程度較低的序列，在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，未在其他物種中檢索到同源序列。與另外兩條探針相比，探針CAAG3602為非轉(zhuǎn)錄序列，不會(huì)受到未被RNA酶降解的殘余核糖體RNA的干擾，因而能夠降低假陽(yáng)性檢出率，顯微鏡下觀察時(shí)視野也較為潔凈，易于雜交信號(hào)的辨識(shí)。

3.2 45S rDNA的染色體定位

多數(shù)鯉科魚類的染色體二倍數(shù)為2n=50［13，25］，這是鯉科魚類的原始核型和進(jìn)化基點(diǎn)。而鯉具有100條染色體 (2n=100)，對(duì)其染色體數(shù)目和DNA含量的分析都顯示，鯉是鯉科魚類原始類群在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件而形成的四倍體物種［26-28］。David等［29］通過(guò)對(duì)鯉基因組非編碼區(qū)59個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的分析，證實(shí)其中有約60%的位點(diǎn)存在復(fù)制現(xiàn)象，并推測(cè)鯉為通過(guò)異種雜交實(shí)現(xiàn)基因組復(fù)制的異源四倍體，其基因組四倍化發(fā)生時(shí)間大約距今1 200萬(wàn)年前。而對(duì)基因組編碼序列的研究表明，與同屬于鯉科的模式生物斑馬魚 (2n=50)相比，鯉大多數(shù)功能基因都存在比斑馬魚多一倍的旁系同源序列［27，29-33］，這些同源序列正是起源于基因組加倍過(guò)程中，來(lái)源于兩套染色體并行使同一功能的基因組序列。

本研究中3條位于45S rDNA序列不同區(qū)域的探針在兩品種鯉染色體上的定位結(jié)果均一致，僅能定位于一對(duì)同源染色體的唯一位點(diǎn)。作為生命活動(dòng)不可或缺的重要基因，45S rDNA這一定位結(jié)果在功能基因分布整體且呈現(xiàn)四倍化特點(diǎn)的鯉基因組內(nèi)是非常顯著的特例，暗示著鯉基因組在經(jīng)歷了染色體整倍化復(fù)制事件后，又呈現(xiàn)出重新二倍化的現(xiàn)象。

圖2 DAPI染色后的散鱗鏡鯉和松浦鯉有絲分裂中期染色體顯微圖Fig.2 Chromosome images of mitotic metaphase in scattered mirror carp and Songpu carp，stained with DAPI

圖3 標(biāo)記探針的電泳圖Fig.3 Electrophoresis images of labeled probes

圖4 探針CAAG1191(A、B)和CAAG3602(C、D)分別在散鱗鏡鯉和松浦鯉染色體上的FISH定位Fig.4 FISH localization of probe CAAG1191(A，B)and CAAG3602(C，D)on chromosomes of scattered mirror carp and Songpu carp，respectively

圖5 探針CAAG1845(紅色)、CAAG1191(綠色)、CAAG3602(綠色)在散鱗鏡鯉和松浦鯉染色體上的FISH共定位Fig.5 FISH co-localization of probe CAAG1845(red)，CAAG1191(green)，and CAAG3602(green)on chromosomes of scattered mirror carp and Songpu carp

通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)，在鯉基因組序列草圖數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)45S rDNA旁系同源序列。在45S rDNA序列的不同位置上設(shè)計(jì)探針進(jìn)行FISH定位，各條探針的定位結(jié)果也均一致，表明45S rDNA位點(diǎn)的重新二倍化并不是由旁系同源序列的逐漸分化所帶來(lái)的，而更可能是因染色體水平的斷裂重排所導(dǎo)致。

3.3 45S rDNA作為染色體特異性標(biāo)識(shí)的意義

與其他物種相比較，鯉染色體呈現(xiàn)出數(shù)目眾多、形態(tài)較為微小的特征。以人類為例，基因組大小為3.0 Gb，具有46條染色體，有經(jīng)驗(yàn)的觀察者在光學(xué)顯微鏡下即可逐一辨認(rèn)各條染色體，并判斷某些染色體異常及其與表型性狀的關(guān)系。而鯉基因組大小約為1.7 Gb［1］，分散成100條染色體，每條染色體長(zhǎng)度都較短，同組的各條染色體之間差異更小，彼此之間很難憑借光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特征進(jìn)行準(zhǔn)確分辨，這給以染色體遺傳規(guī)律為研究對(duì)象的細(xì)胞遺傳學(xué)研究帶來(lái)了很大困難。因此，尋找染色體特異性標(biāo)識(shí)探針在鯉細(xì)胞遺傳學(xué)研究中具有重要意義，它能夠使基因組序列與細(xì)胞學(xué)觀察聯(lián)系起來(lái)，實(shí)現(xiàn)染色體的準(zhǔn)確識(shí)別。

45S rDNA序列則符合這種需求，它在鯉基因組中僅定位于一對(duì)同源染色體上，可以用作該染色體的特異性標(biāo)識(shí)，并將其與已有遺傳連鎖圖譜中特定的連鎖群相對(duì)應(yīng)。孫效文等［2］報(bào)道了鯉的第一個(gè)遺傳連鎖圖譜，45S rDNA位于該圖譜1號(hào)連鎖群上，連鎖群長(zhǎng)度為227 cM，包含15個(gè)標(biāo)記。本研究中所報(bào)道的3條探針均可用作1號(hào)連鎖群的特異性標(biāo)記，可應(yīng)用于鯉細(xì)胞遺傳學(xué)圖譜的構(gòu)建、鯉科魚類比較基因組學(xué)的分析以及染色體結(jié)構(gòu)變異與性狀關(guān)聯(lián)分析等的研究。

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