向蓓,趙文,王媛,田丹
(大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室,遼寧大連116023)
鎘 (Cd)是一種毒性很強的重金屬污染物,主要來源于冶煉、電鍍、蓄電池、采礦等工業(yè)排放的廢水中,對微生物、植物、動物和人體產(chǎn)生強烈的毒害作用。在Cd(Ⅱ)脅迫下,植物體發(fā)生生理應(yīng)激和防御反應(yīng),如合成植物螯合肽 (phytochelatin),以降低Cd(Ⅱ)對機(jī)體的傷害[1]。海洋微藻是海洋初級生產(chǎn)力的重要組成者,對水體環(huán)境的變化非常敏感,進(jìn)入水中的重金屬等污染物首先作用于藻類,通過食物鏈傳遞與富集作用而危害生物健康[2]。已有研究表明,Cd(Ⅱ)能影響藻類的生長代謝,抑制藻類的光合作用,脅迫藻體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基,導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化,也可誘導(dǎo)藻體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗氧化酶活性的升高,在一定程度上清除活性氧自由基,降低細(xì)胞的受損程度[3-5]。
Kerr等[6]首次提出了細(xì)胞凋亡的概念,人們對細(xì)胞凋亡的研究也開始逐漸深入。細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為染色質(zhì)凝聚和片段化、細(xì)胞質(zhì)減少、核片段化、細(xì)胞膜發(fā)泡形成凋亡小體,死亡細(xì)胞很快被鄰近細(xì)胞吞噬而不留痕跡[7-8]。已有研究表明,Cd(Ⅱ)脅迫能引起煙草懸浮細(xì)胞凋亡,這可能是由Cd(Ⅱ)脅迫產(chǎn)生的活性氧物質(zhì) (ROS)所導(dǎo)致的[9]。衣藻能在UV-C脅迫后發(fā)生凋亡,并克隆得到凋亡基因dad1序列[10]。目前對細(xì)胞凋亡的研究多集中在多細(xì)胞的動物和植物,對單細(xì)胞藻類凋亡的研究還很少,且線粒體作為凋亡調(diào)控中心越來越受到人們的重視。鹽藻Dunaliella salina是一種獨特的單細(xì)胞綠藻,無細(xì)胞壁,耐鹽能力強,培養(yǎng)條件便利,是十分重要的藻類資源。為此,本試驗中,作者以鹽藻為材料,研究了不同濃度的Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻生長、抗氧化系統(tǒng)及線粒體膜電位的影響,旨在為進(jìn)一步探索重金屬脅迫對單細(xì)胞藻類的凋亡機(jī)理提供參考資料。
試驗所用鹽藻取自大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室。海水取自大連市黑石礁近岸海域,沉淀后經(jīng)0.45 μm篩網(wǎng)過濾,煮沸消毒,冷卻曝氣后配制培養(yǎng)液,培養(yǎng)液選用f/2營養(yǎng)鹽配方。
試驗所用重金屬鎘以CdCl2·2.5H2O形態(tài)加入。Rhodamine 123購自Sigma公司。
1.2.1 Cd(Ⅱ)脅迫處理 試驗前,將三角錐瓶預(yù)先用高壓滅菌鍋在120℃下滅菌20 min。用培養(yǎng)液對鹽藻進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),當(dāng)鹽藻密度達(dá)到1×106個/mL后,將其分裝到12個250 mL的三角錐瓶中,每瓶加入100 mL。向藻液中加入已配制好的Cd(Ⅱ)母液,使 Cd(Ⅱ)的終濃度分別為0、0.01、0.10、1.00 mmol/L,分別記為對照組和低、中、高濃度組,每組設(shè)3個重復(fù)。將三角錐瓶置于光照培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d,溫度為 (25±1)℃,光照強度為2 500 lx,光暗周期為12 h∶12 h。
1.2.2 細(xì)胞密度的測定 用碘液固定藻液,用血球計數(shù)板計數(shù),每瓶藻液取樣3次進(jìn)行計數(shù)。
試驗進(jìn)行到第7天,收集藻樣并對生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定。
1.2.3 葉綠素a含量的測定 采用以丙酮為萃取液的分光光度法測定葉綠素a的含量[11],用UV-6300 PC型分光光度計分別測定750、664、647、630 nm波長處的吸光值,并分別用波長664、647、630 nm下測得的吸光值減去750 nm下的吸光值,得到校正后的吸光值E664nm、E647nm、E630nm,按下式計算葉綠素a的含量ρ:
式中:V0為樣品提取液的體積 (mL);V為藻液樣品實際用量 (L);L為測定池光程 (cm)。
1.2.4 丙二醛、超氧化物歧化酶、總抗氧化力及可溶性蛋白含量的測定 將藻液濃縮40倍后,對收集的藻細(xì)胞在冰浴中超聲破碎5 min,4℃下以10 000 r/min離心10 min,保留上清液,待測。按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒上注明的方法測定丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化力活性及可溶性蛋白含量。
1.2.5 用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體的膜電位 取1 mL藻液,加入5 μL Rhodamine 123(Rh 123,濃度為500 μg/mL),室溫下孵育30 min,用海水洗兩遍,以去除液體中的Rh 123,用流式細(xì)胞儀測定其熒光強度。Rh 123的激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為530 nm。
采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,并用LSD法進(jìn)行多重比較。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。
從圖1可見:隨著時間的延長,各試驗組鹽藻細(xì)胞數(shù)均不斷增長,在低濃度 Cd(Ⅱ)(0.01 mmol/L)脅迫下,鹽藻生長與對照組無顯著差異(P>0.05);當(dāng)Cd(Ⅱ)濃度為0.10 mmol/L時,前5 d與對照組差異不顯著,但后兩天細(xì)胞生長明顯受到抑制,與對照組有顯著差異 (P<0.05);當(dāng)Cd(Ⅱ)濃度達(dá)到1.00 mmol/L時,鹽藻生長明顯低于對照組 (P<0.05),說明高濃度的Cd(Ⅱ)能抑制鹽藻的生長。
圖1 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻生長的影響Fig.1 Effects of Cd(Ⅱ)stress on the growth of alga Dunaliella salina
從表1可見:低、中濃度Cd(Ⅱ)處理組鹽藻的葉綠素a含量分別比對照組極顯著增加4.57%、48.57%(P<0.01),而高濃度Cd(Ⅱ)組卻比對照組極顯著降低32.11%(P<0.01);中濃度Cd(Ⅱ)處理組可溶性蛋白含量比對照組極顯著增加83.97%(P<0.01),而高濃度Cd(Ⅱ)組卻比對照降低4.85%,但差異不顯著 (P>0.05)。
經(jīng)Cd(Ⅱ)處理7 d后,鹽藻超氧化物歧化酶活性的變化如圖2所示。從圖2可見:隨著Cd(Ⅱ)濃度的增大,鹽藻SOD活性顯著增強,中、高濃度Cd(Ⅱ)處理組SOD活性比對照組分別升高70.16%和21.89%,且差異極顯著 (P<0.01);而低濃度Cd(Ⅱ)組與對照組差異不顯著 (P>0.05)。
表1 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻葉綠素a和可溶性蛋白含量的影響Tab.1 Effects of Cd(Ⅱ)stress on the concentration of Chl a and soluble protein in Dunaliella salina
圖2 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻超氧化物歧化酶活性的影響Fig.2 Effects of Cd(Ⅱ)stress on SOD activities in alga Dunaliella salina
經(jīng)Cd(Ⅱ)處理7 d后,鹽藻中丙二醛含量的變化如圖3所示。從圖3可見:低、中、高濃度Cd(Ⅱ)處理組鹽藻中丙二醛含量分別比對照組升高61.98%、125.00%、35.94%,且差異極顯著(P<0.01),表明Cd(Ⅱ)能引起鹽藻細(xì)胞膜質(zhì)過氧化損傷。
經(jīng)Cd(Ⅱ)處理7 d后,鹽藻總抗氧化力的變化如圖4所示。從圖4可見:低濃度Cd(Ⅱ)處理組鹽藻總抗氧化力低于對照組,但差異不顯著 (P>0.05);中濃度Cd(Ⅱ)處理組總抗氧化力極顯著高于對照組 (P<0.01);高濃度Cd(Ⅱ)處理組的總抗氧化力與對照組無明顯差異 (P>0.05)。
圖3 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of Cd(Ⅱ)stress on concentration of MDA in alga Dunaliella salina
圖4 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻總抗氧化力的影響Fig.4 Effects of Cd(Ⅱ)stress on total antioxidative capacity in alga Dunaliella salina
經(jīng)Cd(Ⅱ)處理7 d后,鹽藻線粒體的膜電位變化如圖5所示。由圖5可見,經(jīng)Cd(Ⅱ)脅迫后鹽藻細(xì)胞線粒體膜電位有下降趨勢,但差異不顯著(P >0.05)。
隨著Cd(Ⅱ)濃度的升高,鹽藻單位細(xì)胞內(nèi)葉綠素a和可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢。0.10 mmol/L的Cd(Ⅱ)處理組鹽藻葉綠素a含量顯著升高,可能是由于較低濃度的Cd(Ⅱ)在一定程度上刺激了藻體葉綠素的合成。而1.00 mmol/L的Cd(Ⅱ)處理組鹽藻葉綠素a含量急劇下降,其機(jī)理可能是:經(jīng)高濃度Cd(Ⅱ)脅迫后能引起葉綠體膨脹破裂,類囊體膜解體,從而導(dǎo)致葉綠素從組織中流失[5];也可能是與Cd(Ⅱ)抑制葉綠素酸酯還原酶活性和影響氨基-γ-戊酮酸的合成有關(guān),而這兩種物質(zhì)分別是葉綠素合成所必需的酶和前體[12]??扇苄缘鞍缀渴侵参矬w代謝過程中的重要指標(biāo),可反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、變性及降解等信息[13]。本研究結(jié)果表明,0.10 mmol/L Cd(Ⅱ)處理組鹽藻可溶性蛋白含量比對照組顯著升高。這可能是較低濃度的Cd(Ⅱ)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生一些抗性蛋白,如金屬硫蛋白等,而這些抗性蛋白能吸附重金屬離子,降低重金屬離子對生物體的毒害[14]。但當(dāng)Cd(Ⅱ)達(dá)到1.00 mmol/L時,可溶性蛋白含量下降,蛋白質(zhì)被破壞。這可能是Cd(Ⅱ)與蛋白相結(jié)合的直接作用,也可能是以DNA為靶點,限制基因表達(dá),從而影響蛋白質(zhì)的合成[15]。
圖5 Cd(Ⅱ)脅迫對鹽藻線粒體膜電位的影響Fig.5 Effects of Cd(Ⅱ)stress on mitochondrial membrane potential in alga Dunaliella salina
丙二醛是多不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物之一,其含量的變化可以反映膜氧化的損傷程度。丙二醛對細(xì)胞有毒性,能引起細(xì)胞膜功能紊亂,且對許多功能分子有破壞作用,因此,丙二醛含量的增加是細(xì)胞損傷的直接原因[16]。本試驗中丙二醛含量先隨Cd(Ⅱ)濃度的增大而升高,說明Cd(Ⅱ)濃度越大對細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷也越大。之后當(dāng)Cd(Ⅱ)濃度達(dá)到1.00 mmol/L時,丙二醛含量下降但仍高于對照組,可能是鹽藻受到不可逆損傷,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝速率大幅度下降[17]。
細(xì)胞受到脅迫后會產(chǎn)生活性氧物質(zhì) (ROS),如超氧根 (·)、氫氧根 (OH-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫 (H2O2)等,這些活性氧物質(zhì)能破壞脂膜類物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及核酸,而超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)清除超氧陰離子自由基 (·)的唯一酶類[18-19]。本試驗中,在 Cd(Ⅱ)脅迫下,鹽藻超氧化物歧化酶活性均高于對照組,且隨著Cd(Ⅱ)濃度的升高呈上升趨勢,表明鹽藻對Cd(Ⅱ)的脅迫有一定的耐受性。這與田丹等[20]的研究結(jié)果不同,可能是因為鹽藻比普通小球藻和湛江等鞭金藻耐受Cd(Ⅱ)的能力更強。在本試驗中Cd(Ⅱ)的設(shè)定濃度范圍內(nèi),鹽藻的超氧化物歧化酶活性可被誘導(dǎo)而升高。Cd(Ⅱ)進(jìn)入鹽藻細(xì)胞后會導(dǎo)致丙二醛的含量升高,而·與丙二醛含量變化具有相關(guān)性[17],因此,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了較多的·,而·可誘導(dǎo)超氧化物歧化酶的活性,即超氧化物歧化酶清除·的能力增強,因而使·能得到及時清除,從而降低·對細(xì)胞的氧化損傷。
總抗氧化力是用于衡量機(jī)體氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo),其變化可以反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)性能的狀態(tài),從總體上反映機(jī)體防御體系抗氧化能力的高低[21]。本試驗結(jié)果表明,當(dāng)Cd(Ⅱ)達(dá)到0.10 mmol/L時,鹽藻的總抗氧化力增強。其原因可能是較低濃度的Cd(Ⅱ)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧物質(zhì),進(jìn)而啟動細(xì)胞防御反應(yīng),使得總抗氧化力暫時升高。當(dāng)Cd(Ⅱ)的濃度增大到1.00 mmol/L時,對一些抗氧化酶類產(chǎn)生抑制,從而使細(xì)胞的總抗氧化力降低。
近年來,線粒體作為細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心越來越受到人們的重視。線粒體跨膜電下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的共同途徑。在正常情況下,機(jī)體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)處于一種動態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)這種平衡被打破時,活性氧水平較高,線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔開放,導(dǎo)致膜電位丟失,各種凋亡促進(jìn)因子釋放到胞質(zhì)中,激活caspase,誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[22-24]。本試驗結(jié)果表明,隨著Cd(Ⅱ)濃度的增加,鹽藻細(xì)胞線粒體膜電位呈下降趨勢,但各處理組與對照組差異不顯著。這可能是因為本試驗中Cd(Ⅱ)的脅迫濃度較低,鹽藻對較低濃度的Cd(Ⅱ)表現(xiàn)不十分敏感。
綜上所述,一定濃度的Cd(Ⅱ)能抑制鹽藻的生長,抑制葉綠素 a及可溶性蛋白的合成;Cd(Ⅱ)進(jìn)入細(xì)胞后,使細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧,導(dǎo)致膜氧化的損傷程度加重,丙二醛含量升高,而活性氧又能誘導(dǎo)超氧化物歧化酶活性升高,超氧化物歧化酶歧化·生成O2和H2O2,從而保護(hù)細(xì)胞不受到自由基的氧化損傷;細(xì)胞活性氧的水平升高,促進(jìn)了總抗氧化能力提高,從而降低活性氧對細(xì)胞的傷害,保護(hù)線粒體膜的完整性,維持線粒體膜電位,抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
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