用飼料酵母替代魚粉對大菱鲆幼魚生長及免疫機能的影響

崔敏，郭冉，夏輝

(河北農業(yè)大學海洋學院，河北秦皇島066000)

大菱鲆Scophthatmus maximus俗稱多寶魚，其生長速度快、肉質細嫩、口感獨特，是中國重要的海水養(yǎng)殖種類之一。據(jù)統(tǒng)計，2009年中國鲆鰈類總產量為7.9～8.9萬t，其中總產量的92%來自山東、河北、天津、遼寧4個環(huán)渤海灣主產區(qū)，大菱鲆產量占到總產量的55%，2010年大菱鲆的產量達到 5 萬 t［1］。

大菱鲆對飼料中蛋白質的需求量較高，尤其是幼魚。當飼料中蛋白的質量分數(shù)低于39%時，幼魚生長緩慢;只有當?shù)鞍椎馁|量分數(shù)高于42%時，大菱鲆幼魚才會快速生長［2］。眾所周知，在水產動物的飼料原料中，最緊缺的就是飼料蛋白源，積極開發(fā)飼料蛋白源具有較高的經(jīng)濟效益和社會效益。目前，對漁用蛋白源的研究主要集中在動物性蛋白源、植物性蛋白源、單細胞蛋白源等幾個方面。本試驗中所使用的飼料酵母屬單細胞蛋白，它是以淀粉企業(yè)生產淀粉和葡萄糖的廢棄物為底物，以產朊假絲酵母Candida utilis為菌種，經(jīng)過一系列的發(fā)酵、蒸干、噴霧干燥等工藝加工而成。該飼料酵母中蛋白質的質量分數(shù)可達46.36%，粗脂肪、粗纖維的質量分數(shù)分別為1.71%和0.04%，總氨基酸的質量分數(shù)為36.04%，賴氨酸含量較高，蛋氨酸含量較少，營養(yǎng)十分豐富。如能充分利用該飼料酵母作為蛋白來源最大限度地替代魚粉，不僅可以減少魚粉的使用量，降低生產成本，還能充分利用中國的糟渣資源，解決環(huán)境污染問題。

目前關于飼料酵母對魚類生長影響的研究較多，大多集中在用飼料酵母替代魚粉后對魚類的增重率、飼料系數(shù)等指標的影響，研究對象多為鯉Cyprinus carpio［3］、建 鯉 Cyprinus carpiovar jian［4］、羅 非 魚 Oreochromis mossambicus［5］和 淡 水 白 鯧Ephippusorbis［6］等。免疫學指標是魚類生理學、營養(yǎng)與飼料的主要研究內容之一。酶活力是反映魚類免疫機能的重要指標。目前，對水產動物免疫學指標的探索主要集中在酵母培養(yǎng)物、酵母細胞壁和酵母膏上［7-10］，但飼料酵母對大菱鲆免疫機能的影響還未見系統(tǒng)的報道。本研究中，作者采用營養(yǎng)學和免疫學方法，探索飼料酵母替代魚粉的可行性及其在大菱鲆飼料中適宜的添加比例，以期為飼料酵母的應用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

大菱鲆幼魚購于秦皇島天合水產良種有限公司，體質量為 (9.02 g±0.15 g)，共195尾。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料的配制 試驗中所用魚粉為秘魯魚粉，粗蛋白質量分數(shù)為68%。飼料酵母由秦皇島驪驊淀粉股份有限公司生產和提供，粗蛋白質量分數(shù)為46.36%。試驗中分別用質量分數(shù)為0、15%、30%、45%、60%的飼料酵母替代飼料中0、17%、34%、51%、68%的魚粉，配制成5種等氮、等能的試驗飼料，分別記為Ⅰ (對照組)、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組。飼料配方及飼料的營養(yǎng)成分見表1。根據(jù)飼料配方將所有飼料原料用粉碎機進行粉碎，過80目篩，混勻，擠壓成直徑為1.5 mm的硬顆粒飼料，干燥后密封于冰箱 (-20℃)中保存，備用。

表1 飼料組成及營養(yǎng)成分Tab.1 The ingredients and composition of the experimental diets w/%

1.2.2 試驗設計及飼養(yǎng)管理

將大菱鲆幼魚隨機分為5組，每組設3個重復，每個重復組放養(yǎng)13尾魚。試驗在室內循環(huán)流水的水族箱 (60 cm×40 cm×50 cm)中進行，內盛水120 L，用試驗飼料馴化10 d后開始試驗。試驗期間，水溫為 (18.0±1.0)℃，pH為 (7.6±0.4)，溶氧大于8 mg/L，鹽度為 (30.60±0.02)。每天飼喂3次 (7:00、12:00和18:00)，投飼率為體質量的3%～4%。每14 d調整一次投喂量，試驗持續(xù)56 d。

1.2.3 樣品的采集 試驗結束后，禁食1 d，每箱隨機取3尾魚稱重，置于105℃下烘干［11］，然后用微型粉碎機粉碎、稱重，裝入密封袋中并置于冰箱(-20℃)中冷凍保存，用于測定其粗蛋白、粗灰分和粗脂肪含量［12-13］。另從每箱中隨機取3尾魚，麻醉處理后，測其體長和體質量，然后用2.5 mL一次性無菌注射器 (含肝素鈉)從心臟采血，并置于冰箱 (4℃)中過夜，以3 000 r/min于4℃下離心10 min，分離血漿，將收集的血漿保存于冰箱(-80℃)中，待測。

1.2.4 體成分的測定 飼料及魚體成分均采用國標中的方法測定。采用105℃烘箱干燥法測定干物質的質量，采用馬弗爐灼燒法 (550℃)測定粗灰分含量，采用凱氏定氮法測定粗蛋白質含量，采用索氏抽提法 (以石油醚為溶劑)測定粗脂肪含量［14］。

1.2.5 生化指標的測定 采用考馬斯亮藍染色法測定血漿中的總蛋白，采用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶 (super oxide dismutase，SOD)的活力，采用磷酸苯二鈉比色法測定堿性磷酸酶 (alka-line phosphatase，AKP)的活力，參照 Yin等［15］的方法測定溶菌酶 (lysozyme)的活力，以上指標均用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定。測定殺菌活性 (bactericidal activity)時，以大腸桿菌為底物，在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，用0.067 mol/L的PBS(pH 6.4)洗滌成菌懸液，使其OD570nm≈0.3。取2 mL配制好的大腸桿菌菌懸液放入試管中，加入20 μL血漿，混勻，測其吸光度A0;然后將試管移入37℃下水浴30 min，取出后立即冰浴10 min，測其吸光度A，用下列公式計算殺菌活性 (UL):

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結果用平均數(shù)±標準誤 (mean±S.E.)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，先對數(shù)據(jù)作單因素方差分析 (One-way ANOVA)，若組間差異顯著，再用Duncan's法進行多重比較，顯著水平為0.05。

增重率=(末均質量-初均質量)/初均質量×100%，

特定生長率=(ln末體質量-ln初體質量)/試驗天數(shù)×100%，

成活率=(試驗末魚尾數(shù)/試驗初魚尾數(shù))×100%，

飼料系數(shù)=攝食飼料總量/魚體增重量，

蛋白質效率=魚體增重量/蛋白質攝取量，

肝體指數(shù)=肝臟質量/魚體質量×100%，

內臟指數(shù)=內臟質量/魚體質量×100%，

肥滿度=體質量(g)/體長3(cm)×100%。

2 結果

2.1 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對大菱鲆幼魚生長性能的影響

從表2可見:Ⅱ組大菱鲆幼魚的增重率和特定生長率均最高，但與對照組相比均無顯著差異 (P＞0.05);Ⅱ組幼魚的飼料系數(shù)最低，Ⅴ組幼魚的飼料系數(shù)最高，除Ⅴ組與對照組差異顯著 (P＜0.05)外，其余試驗組與對照組之間的差異均不顯著 (P＞0.05);Ⅱ組幼魚的蛋白質效率最高，除Ⅳ、Ⅴ組顯著低于對照組外 (P＜0.05)，其余試驗組與對照之間的差異均不顯著 (P＞0.05);Ⅱ組和Ⅳ組幼魚的成活率比對照組顯著提高15.15%和12.11%(P＜0.05)，而Ⅴ組比對照組顯著降低12.12%(P ＜0.05)。

表2 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對大菱鲆幼魚生長性能及飼料利用的影響Tab.2 The effects of partial replacement of fish meal by feed yeast on growth performance and feed conversion in turbot Scophthalmus maximus

2.2 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對大菱鲆幼魚形體指標的影響

從表3可見:Ⅱ組與Ⅲ組大菱鲆幼魚的肝體指數(shù)分別比對照組顯著提高83.08%和61.54%(P＜0.05)，Ⅳ組與對照組沒有顯著差異 (P＞0.05)，而Ⅴ組幼魚的肝體指數(shù)比對照組顯著降低69.23%(P＜0.05);Ⅱ組幼魚的內臟指數(shù)比對照組顯著提高24.60%(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組和Ⅴ組與對照組差異均不顯著 (P＞0.05);Ⅱ組和Ⅴ組幼魚的肥滿度與對照組無顯著差異 (P＞0.05)，Ⅲ、Ⅳ組幼魚的肥滿度分別比對照組提高15.74%和12.99%(P＜0.05)，但Ⅲ、Ⅳ組之間差異不顯著 (P＞0.05)。

2.3 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對大菱鲆幼魚體成分的影響

由表3可見:全魚水分和粗脂肪含量隨著替代比例的增加沒有顯著性差異 (P＞0.05);Ⅱ組大菱鲆幼魚的粗蛋白含量顯著高于對照組 (P＜0.05)，Ⅲ組與對照組差異不顯著 (P＞0.05)，Ⅳ組和Ⅴ組顯著低于對照組 (P＜0.05);Ⅱ組大菱鲆幼魚的灰分含量顯著低于對照組 (P＜0.05)，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的灰分含量則分別高于對照組12.82%、22.01%和23.07%(P＜0.05)，但Ⅳ組和Ⅴ組之間無顯著差異 (P＞0.05)。

表3 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對大菱鲆幼魚形體指標和體成分的影響Tab.3 The effects of partial replacement of fish meal by feed yeast on morphological indicators，and whole body composition in turbot Scophthalmus maximus %

2.4 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對大菱鲆幼魚免疫機能的影響

從表4可見:隨著替代比例的增加，各試驗組與對照組大菱鲆幼魚血清中堿性磷酸酶的活性和殺菌活性差異均不顯著 (P＞0.05);Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組幼魚血清中溶菌酶的活性與Ⅳ、Ⅴ組之間差異均顯著 (P＜0.05)，其余組間均無顯著差異 (P＞0.05);Ⅱ組幼魚血清中超氧化物岐化酶活性與對照組無顯著差異 (P＞0.05)，Ⅲ、Ⅳ組和Ⅴ組均比對照組低29.32%、27.20%和34.15% (P＜0.05)，其余組間均無顯著差異 (P＞0.05);Ⅱ組和Ⅲ組幼魚血漿中的蛋白含量與對照組差異不顯著(P＞0.05)，Ⅳ組和Ⅴ組比對照組降低32.47%和35.55%(P＜0.05)，其余組間均無顯著差異 (P＞0.05)。

表4 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對大菱鲆幼魚免疫機能的影響Tab.4 The effects of partial replacement of fish meal by feed yeast on immune efficiency in turbot Scophthalmus maximus

3 討論

諸多研究表明［16-20］，在魚類飼料中，用飼料酵母部分或全部替代魚粉是可行的，但是要根據(jù)養(yǎng)殖魚的種類和食性的差異來調整飼料配方，以滿足魚類對營養(yǎng)的需求。本試驗中，用飼料酵母替代17%的魚粉 (Ⅱ組)時，大菱鲆幼魚的生長性能最佳。這與張梁等［6］網(wǎng)箱養(yǎng)殖淡水白鯧的結果相同。

本試驗結果表明，Ⅱ組大菱鲆幼魚的成活率、增重率、特定生長率和蛋白質效率最高，但幼魚的增重率、特定生長率和蛋白質效率均隨飼料酵母替代比例的升高而下降。這說明適量的酵母有利于大菱鲆幼魚的生長，但隨著飼料中酵母含量的增加會影響大菱鲆幼魚對飼料的轉化率，從而導致大菱鲆幼魚的增重率和成活率下降。但葛樹立等［5］用活性酵母養(yǎng)殖羅非魚時，隨著替代比例的增加，試驗魚的增重率增加，飼料系數(shù)降低，表明活性酵母可以明顯促進羅非魚的生長。其原因可能與養(yǎng)殖魚的種類以及酵母的來源、組成等有關。用較高比例的飼料酵母替代魚粉時，也同樣降低了鯉［3］、淡水白鯧［6］、胡子鯰［19］的攝食與生長，這可能是高濃度的飼料酵母引起魚體的免疫反應過度，導致用于生長的能量和營養(yǎng)素減少的緣故。Rumsey等［21］則認為，完整的酵母細胞因存在細胞壁，無法使胞內的營養(yǎng)成分釋放出來，因而魚類利用高含量酵母的能力較差。

幼魚的消化系統(tǒng)發(fā)育不及成魚完善，對各種環(huán)境因子 (運輸、儲藏、食物因子、水質理化因子等)尤其是食物因子的變化反應比較敏感，當飼料中添加大量飼料酵母時，可能會對消化系統(tǒng)的發(fā)育產生一定的影響，肝體指數(shù)和內臟指數(shù)會發(fā)生較大變化。本試驗中，Ⅱ組大菱鲆幼魚的肝體指數(shù)、肥滿度和內臟指數(shù)均高于對照組，說明一定比例的飼料酵母會刺激魚體形體的生長，改善肝功能。但黃鈞等［5］用加酶飼料酵母替代魚粉飼養(yǎng)豐鯉時，魚粉組的肥滿度顯著高于各飼料酵母替代組。

隨著飼料酵母替代比例的增加，全魚的水分和脂肪含量無明顯變化，粗蛋白含量逐漸降低，灰分含量逐漸升高。當用飼料酵母替代魚粉的比例為51%(Ⅳ組)和68%(Ⅴ組)時，大菱鲆幼魚的粗蛋白含量顯著下降，表明用飼料酵母替代魚粉的比例過高時會影響蛋白質在魚體內的沉積，這與高含量飼料酵母組的幼魚對飼料的利用率較低有關?？傮w來看，Ⅱ組幼魚的粗蛋白含量最高，顯著高于對照組，而其粗脂肪含量又最低，說明飼料中添加質量分數(shù)為15%的飼料酵母能夠增加魚體的蛋白質含量，減少脂肪的堆積，顯著提高了魚肉的品質，使魚肉更加鮮嫩可口。

溶菌酶廣泛存在于動物體內的許多組織和體液中，是殺滅病原菌的物質基礎。血漿中的溶菌酶主要來自血細胞，是一種堿性球蛋白，能夠專一性地水解肽多糖分子中β-1，4糖苷鍵，從而破壞并裂解細胞壁，最終使細菌死亡，實現(xiàn)其機體的防御功能［22-23］。測定魚體的溶菌酶活性，可以在一定程度上反映魚類非特異性體液的免疫狀態(tài)。

血漿中的蛋白，如免疫球蛋白 (IgM)、補體等蛋白含量以及殺菌活性也可以作為魚類的免疫指標。本試驗中，各組間幼魚的殺菌活性沒有顯著性差異，而血漿中的蛋白含量和溶菌酶含量均是Ⅱ組最高，當用飼料酵母替代魚粉的比例增加時，幼魚的殺菌活性反而下降。這說明飼料酵母可能會抑制血漿中的蛋白生成和溶菌酶的活性。但有些研究結果與此相反，如Baulny等［24］曾報道，酵母β-葡聚糖能增強大菱鲆的溶菌酶活性;陳超然等［9］的研究表明，各試驗組魚體血清中總蛋白的含量隨著酵母β-葡聚糖添加量的增加而提高。

堿性磷酸酶是一種非特異性磷酸水解酶，能催化磷酸單脂的水解及磷酸基團的轉移反應，對動物生存具有重要的意義。本試驗中，隨著飼料酵母添加比例的增加，堿性磷酸酶酶活性沒有顯著性的差異。而胡火庚等［8］的研究表明，隨著酵母復合物添加量的增加，中華絨螯蟹血清中堿性磷酸酶的活性顯著上升，表明酵母復合物對中華絨螯蟹的非特異免疫力有增強作用。

超氧化物歧化酶具有催化超氧離子自由基進行歧化反應的功能，是機體清除氧自由基的重要抗氧化保護酶，它能使自由基的形成和清除處于一種動態(tài)平衡，從而清除自由基對機體的危害，保護細胞免受損傷。當SOD活性降低時，其自由基等毒害物質就會積累。本試驗中，血漿中的蛋白含量和SOD活性也都隨著飼料酵母添加比例的增加而減少，說明添加高比例的飼料酵母可以減弱機體的免疫能力，這可能也是導致Ⅴ組死亡率增加的重要原因之一。然而，一些國外專家認為，飼料酵母同益生菌有同樣的效果，可以提高動物的免疫系統(tǒng)，增強抵抗微生物入侵的能力。關于飼料酵母對大菱鲆免疫因子的影響還有待進一步研究。

綜上所述，用飼料酵母替代飼料中17%左右的魚粉時，可以使大菱鲆的生長、成活率、機體營養(yǎng)成分和免疫機能優(yōu)于其它各組。

［1］楊正勇，王春曉，冷傳慧，等.國內外鲆鰈類養(yǎng)殖生產與貿易動態(tài)研究報告［R］.上海:上海海洋大學，2009:13-18.

［2］馬愛軍，陳四清，雷霽霖，等.飼料中主要能量物質對大菱鲆幼魚生長的影響［J］.海洋與湖沼，2001，32(5):527-533.

［3］呂迅，于偉君，王丹，等.酵母替代魚粉養(yǎng)鯉試驗［J］.水產科學，1991，10(3):5-9.

［4］胡迪先，夏先林，程園，等.飼料酵母替代魚粉作餌料的研究［J］.中國飼料，1995(4):19-20.

［5］葛樹立.多維高蛋白活性飼料酵母養(yǎng)魚試驗［J］.河北漁業(yè)，2001(1):32.

［6］張梁，周維祿，楊世平.飼料酵母替代部分魚粉養(yǎng)殖淡水白鯧試驗［J］.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W校學報，2003，23(1):4-5.

［7］汪成竹，姚娟，陳昌福.酵母復合物對斑點叉尾鮰的免疫調節(jié)作用［J］.現(xiàn)代農業(yè)科技，2008，11:262-264.

［8］胡火庚，陳昌福.飼料中添加酵母復合物對中華絨螯蟹的免疫調節(jié)作用［J］.長江大學學報:自然版，農學卷，2007，4(2):36-40.

［9］陳超然，陳萱，陳昌福，等.酵母對受免異育銀鯽免疫應答的增強作用［J］.華中農業(yè)大學學報，2003，22(4):380-384.

［10］陳國鳳，龔宏偉，施陳江，等.酵母膏對異育銀鯽生長和抗應激能力的影響［J］.飼料工業(yè)，2009，30(18):22-25.

［11］Williams S.Official Methods of Analysis［M］.Washington D C，USA:AOAC，1984.

［12］Folch J，Lees M，Sloane-Stanley G H.A simple method of the isolation and purification of total lipid from animal tissues［J］.Journal of Biology and Chemical，1957，226:497-509.

［13］Delsal J L.New process for extracting lipids form serum by methylal:application to micro dosages of total cholesterol，phosphoaminolipids，and proteins［J］.Bulletin of the Society of Chemical Biology，1944，26:99-105.

［14］Woyewoda A D，Shaw S J，Ke P J，et al.Recommended laboratory methods for assessment of fish quality［J］.Canadian Technical Report of Fisheries and Aquatic Sciences，1986，1448:28-31.

［14］周歧存，麥康森，劉永堅，等.動植物蛋白源替代魚粉研究進展［J］.水產學報，2005，29(3):404-410.

［15］Yin G，Jeney G，Race T，et al.Effect of two Chinese herbs(Astragalus radix and Scutellaria radix)on non-specific immune response of tilapia Oreochromis niloticus［J］.Aquaculture，2006，253:39-47.

［16］Lim E H，Lain T J，Ding J L，et al.Single-cell protein diet of a novel recombinant vitellogen in yeast enhances growth and survival of first-feeding tilapia(Oreochromis mossambicus)larvae［J］.The Journal of Nutrition，2005，135(3):513-518.

［17］Sanderson G W，Jolly S O.The value of phaffia yeast as a feed ingredient for ingredient for salmonid fish［J］.Aquaculture，1994，124:193-200.

［18］Tacon A G.Feed ingredients for carnivorous fish species alternatives to fishmeal and other dietary resources［J］.FAO Fish Circle，1994，881:35.

［19］程光平，黃鈞，夏中生，等.酵母蛋白替代魚粉飼養(yǎng)胡子鯰試驗［J］.廣西農業(yè)生物科學，2001，20(1):41-44.

［20］杜濤，黃洋，羅杰.酵母輪蟲和以小球藻、螺旋藻強化的輪蟲對3種仔魚人工育苗效果的影響［J］.大連水產學院學報，2010，26(2):158-161.

［21］Rumsey G L，Hughes S G，Kinsella L.Use of dietary yeast Saccharomyces cerevisiae nitrogen by lake trout［J］.J World Aquaculture Society，1990，21:205-209.

［22］Aoki T，Takami K，Kitao T.Drug resistance in a non-haemolytic Streptoccus isolated from cultured yellowtail Seriola quinqueradiata［J］.Diseases of Aquatic Organisms，1990，8(2):171-177.

［23］Anderson D P，Siwicki A K.Duration of protection against Aeromonas salmonicida in brook trout immunostimulated with glucan or chitosan by injection or immersion［J］.The Progressive Fish Culture，1996，56(3):258-261.

［24］Baulny M O D，Quentel C，F(xiàn)ournier V，et al.Effects of long-term oral administration of β-glucan as an immunostimulant or an adjuvant on some non-specific parameters of the immune response of turbot，Scophthalmus maximus［J］.Diseases of Aquatic Organisms，1996，26:139-147.