中間球海膽精子超低溫冷凍保存方法的研究

劉志丹，李霞，秦艷杰

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

種質(zhì)細(xì)胞冷凍保存始于20世紀(jì)50年代［1］，該技術(shù)發(fā)展至今已取得很大成就。其中哺乳動物精子冷凍保存發(fā)展比較成熟，在人類生殖和畜牧業(yè)良種生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用，如精子庫的建立。關(guān)于水產(chǎn)動物精子的超低溫冷凍保存技術(shù)國內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了研究，報(bào)道較多的為魚類和貝類［2-7］。目前，關(guān)于海膽精子超低溫保存技術(shù)的研究國外已有報(bào)道［8-9］，而關(guān)于中間球海膽 Strongylocentrotus intermedius冷凍保存技術(shù)的研究卻很少，僅見王笑月等［10］對此進(jìn)行了初步研究。

中間球海膽的味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值較高，因而深受國內(nèi)外市場的歡迎，現(xiàn)已成為中國北方海水養(yǎng)殖的主要種類之一。自20世紀(jì)90年代從日本引進(jìn)中間球海膽后，由于近親交配和環(huán)境等因素的影響，造成該種質(zhì)退化并出現(xiàn)病害等問題，所以每年需從原產(chǎn)地引種。然而，大規(guī)模的運(yùn)輸帶來費(fèi)用提高、種膽死亡以及繁瑣的檢疫等一系列問題，而建立海膽精子庫則可以解決上述難題，同時對海膽種質(zhì)資源的保存也有一定的意義。本試驗(yàn)中，作者研究了用超低溫冷凍方法保存中間球海膽精子，以期為中間球海膽精子庫的建立提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

種海膽于2009年5—6月取自大連新碧龍海產(chǎn)有限公司，選取性腺發(fā)育成熟的中間球海膽，在實(shí)驗(yàn)室中暫養(yǎng)，每日換水一次，換水量為1/2。

從中間球海膽圍口膜處注射0.075 mol/L KCl 1 mL，然后單個放在50 mL燒杯上，待精卵產(chǎn)出后分別收集。

1.2 方法

1.2.1 不同降溫方式對精子存活率和受精率的影響試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將鮮精液與用煮沸消毒海水配制的DMSO(體積分?jǐn)?shù)為10%)冷凍保存液按體積比1∶1混合后裝入1.8 mL凍存管中。將凍存管放入冰箱 (4℃)內(nèi)平衡10 min后，懸于液氮面上方進(jìn)行預(yù)冷，預(yù)冷方式分為4組:D1組，于液氮面上方3 cm(約-160℃)處停留8 min;D2組，于液氮面上方15 cm(約-60℃)處停留8 min;D3組，于液氮面上方15、3 cm處分別停留3 min和5 min;D4組，直接浸入液氮(-196℃)中，預(yù)冷后將各組凍存管均浸入液氮中，24 h后解凍，觀察精子的存活率和受精率。

1.2.2 冷凍保存液的篩選 根據(jù)“1.2.1”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，以煮沸消毒海水為基礎(chǔ)液添加不同濃度的DMSO、甘油、海藻糖配制成不同濃度的冷凍保護(hù)液，分別記為對照組、A1～A13組。將不同濃度的冷凍保護(hù)液與鮮精液按體積比1∶1混合裝入1.8 mL凍存管中，于冰箱 (4℃)內(nèi)平衡10 min，然后在液氮面上方15、3 cm處分別停留3 min和5 min，最后浸入液氮中保存。24 h后解凍，統(tǒng)計(jì)精子的存活率和受精率。冷凍保護(hù)液配方見表1。

表1 冷凍保護(hù)液的配方Tab.1 Formula of antifreezers

1.2.3 平衡時間的選擇 將鮮精液與A11冷凍保護(hù)液按體積比1∶1混合后裝入1.8 mL凍存管中，最終體積為1 mL。將凍存管于冰箱 (4℃)中分別平衡0、5、10、15、20、30 min，取出后在液氮面上方15、3 cm處分別停留3 min和5 min，然后將凍存管浸入液氮中，24 h后取出凍存管解凍，統(tǒng)計(jì)精子的存活率和受精率。

1.2.4 葡萄糖對精子受精率的影響 將鮮精液與抗凍液A11按1∶1混合后，于冰箱 (4℃)內(nèi)平衡15 min，按照“1.2.1”節(jié)中D3組的降溫方式冷凍，冷凍保存24 h后解凍，統(tǒng)計(jì)精子的存活率后進(jìn)行受精。將精子放入受精海水中，分別加入濃度為0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖 (分別記為A、B、C、D、E組)，統(tǒng)計(jì)精子的受精率。

1.2.5 解凍 解凍時將浸入液氮內(nèi)的凍存管取出，懸于液氮面上方15 cm處平衡5 min，然后迅速放入水浴鍋中 (22±2℃)解凍。

1.2.6 存活率、受精率的統(tǒng)計(jì) 用5 g/L的臺盼藍(lán)于室溫下染色15 min，在顯微鏡下觀察精子的存活率。死亡精子的頂體部或核體部呈藍(lán)色，活精子不著色。每次統(tǒng)計(jì)200個精子，重復(fù)3次［11］，計(jì)算存活率:

將解凍后的精子與新鮮卵子混合受精，精子與卵子的比例為1 000∶1。每次統(tǒng)計(jì)100個卵子，重復(fù)3次，計(jì)算其受精率。受精率以發(fā)育至原腸胚的卵子數(shù)占全部統(tǒng)計(jì)數(shù)的百分比來表示。

上述試驗(yàn)選取新鮮精子的存活率均在90%以上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用One Way-ANOVA法進(jìn)行方差分析，若差異顯著則采用Ducan's多重比較方法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 降溫方式對精子存活率和受精率的影響

從表2可見:采用在液氮面上方15、3 cm處分別停留3 min和5 min(D3組)的降溫方式對精子的冷凍效果好于其他組，精子的存活率和受精率分別為24.7%±3.8%和8.3%±2.5%，而直接浸入液氮中 (D4組)的效果最差。

表2 不同降溫方式對冷凍精子存活率和受精率的影響(n=3)Tab.2 Effect of different freezing ways on post-thawed sperm survival rate and fertilization rate(n=3)

2.2 冷凍保護(hù)液的篩選

本試驗(yàn)結(jié)果表明:隨著甘油添加量的增加，A1～A9試驗(yàn)組精子解凍后的存活率和受精率先增加后下降，其中A4試驗(yàn)組凍存效果最好，冷凍后精子存活率和受精率分別為48.83%±2.40%和15.37%±10.00%;在A4組冷凍保護(hù)液基礎(chǔ)上添加適量海藻糖能夠提高冷凍后精子的存活率和受精率，海藻糖添加的最佳濃度為25 mmol/L，在添加此濃度的抗凍液 (A11)組中精子的存活率和受精率最高，分別達(dá)到54.2%±4.4%和23.0%±3.2%(圖1)。

圖1 抗凍保護(hù)液對冷凍精子存活率和受精率的影響Fig.1 Effect of cryoprptectant type on post-thawed sperm survival rate and fertilization rate

2.3 平衡時間對精子冷凍效果的影響

從表3可見:冷凍精子解凍后的存活率和受精率均隨平衡時間的增加先上升后下降，平衡時間為15 min時，精子的存活率和受精率達(dá)到最高，分別為58.2%±4.0%和24.7%±2.9%。平衡時間為15 min的冷凍精子與平衡時間為20、40 min的兩組冷凍精子相比，解凍后精子的存活率變化不顯著(P＞0.05)，但受精率卻顯著下降 (P＜0.05)。

表3 4℃下平衡時間對冷凍精子存活率和受精率的影響Tab.3 Effect of equilibration time at 4℃on postthawed sperm survival rate and fertilization rate

2.4 添加葡萄糖對冷凍精子受精率的影響

從表4可見:精子冷凍后在受精液中添加適量的葡萄糖有助于提高精子的受精率，其中C組受精率最高 (29.0% ±0.6%)，顯著高于對照組(A組)(23.0% ±1.0%)(P＜0.05)，而E組(15.7%±2.1%)卻顯著低于對照組(P＜0.05)，其它試驗(yàn)組與對照組差異均不顯著(P＞0.05)。

表4 葡萄糖對解凍后精子受精率的影響Tab.4 Effect of glucose on post-thawed sperm fertilization rate

3 討論

3.1 降溫方式對精子凍存效果的影響

降溫方式從速率上大致分為慢速冷凍和快速冷凍。由于快速冷凍與慢速冷凍相比，不易形成大冰晶，對細(xì)胞的損傷較小，現(xiàn)已被多數(shù)學(xué)者采用［2-6］。楊愛國等［2］采用距液氮表面 25、20、10 cm處各停留8 min的降溫方式對扇貝精子進(jìn)行超低溫保存，效果較好。李純等［3］用程序冷凍儀在超低溫保存櫛孔扇貝Chlamys farreri精子時發(fā)現(xiàn)，以20℃/min的降溫速率方式來保存精子，其效果最佳。史東杰等［4］以體積分?jǐn)?shù)為16%的DMSO為抗凍劑，采用五步降溫的方式冷凍保存缺簾魚Bryconcophalus精子并獲得成功。本試驗(yàn)中，作者采用分步降溫冷凍方式，通過查看液氮面上方不同高度間的溫度確定降溫方式［5］，在液氮面上方15 cm(約-60℃)和3 cm(約-160℃)處分別停留3 min和5 min后浸入液氮中，對精子的保存效果較好。楊培民等［6］在對蝦夷扇貝Patinopecten yessonesis進(jìn)行冷凍保存時也得出類似的結(jié)果。

3.2 冷凍保護(hù)液的篩選

在精液中加入冷凍保護(hù)液后，通過提高精子細(xì)胞質(zhì)的濃度、降低冰點(diǎn)等作用來降低對精子的冷凍損傷。目前常用的冷凍保護(hù)劑有DMSO和甘油。DMSO的滲透力強(qiáng)，親水性好，能快速滲透進(jìn)精子細(xì)胞內(nèi)，降低精子細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的濃度;而甘油可防止細(xì)胞脫水，并能保護(hù)精子蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。但兩者在濃度較高的情況下都會對精子產(chǎn)生一定的毒害作用。陳東華［12］研究發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下，甘油對精子的損傷程度明顯低于DMSO，但隨著濃度的增加，DMSO對精子的損傷程度增強(qiáng)。Anchordoguy等［13］研究了用DMSO保存銳脊單肢蝦Sicyonia ingentis精子的效果，結(jié)果表明，用體積分?jǐn)?shù)為5%的DMSO效果較好。Liliana等［14］的研究表明，在凍存紅鮑Halioti rufescens精子時，采用體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油對精子的凍存效果要好于體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO。

此外，海藻糖作為一種無毒無害的非特異性保護(hù)劑，它的抗脫水、抗高滲保護(hù)以及抗冷凍保護(hù)作用已逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。Suzuki等［15］在常用的保護(hù)劑中加入海藻糖，當(dāng)濃度為5～100 mmol/L時，能大大提高冷藏解凍的牛卵母細(xì)胞的受精率。Beattie等［16］的研究結(jié)果表明，海藻糖對于長期冷藏的人胰島器官有增強(qiáng)活力和保護(hù)的功能。Eroglu等［17］報(bào)道了冷凍保存時加入低濃度的海藻糖后，能大大提高哺乳動物細(xì)胞的存活率。

目前已有的研究中大多使用單一抗凍液，但單一冷凍保護(hù)劑各有優(yōu)缺點(diǎn)，不能滿足精子冷凍保存時對各方面條件的要求。若將各種冷凍保護(hù)液有機(jī)地結(jié)合起來，會達(dá)到較好的效果［18］。本試驗(yàn)中將DMSO(10%)、甘 油 (6%)、海 藻 糖 (25 mmol/L)混合組成冷凍保護(hù)液，結(jié)果表明，解凍后精子的存活率和受精率明顯提高，分別達(dá)到54.2%和29.0%。

3.3 平衡時間對精子凍存效果的影響

將添加了冷凍保護(hù)液的精液在低溫條件下平衡，是為了使?jié)B透型抗凍保護(hù)劑能充分滲入精子內(nèi)部，提高細(xì)胞內(nèi)的溶液濃度，降低冰點(diǎn)，減少胞內(nèi)結(jié)冰對細(xì)胞的損傷，提高保存材料對低溫的耐受能力［19］。但平衡時間過長，則會對精子造成損傷，所以選擇合適的平衡時間，對于達(dá)到超低溫冷凍保存精子的效果是非常重要的。

不同物種精子的滲透能力不同，所需的平衡時間也不盡相同。Bougrier等［20］認(rèn)為，太平洋牡蠣Crassostrea gigas精子在冷凍保護(hù)液中的平衡時間不宜超過3 min，否則精子的受精率就會下降。Basavaraja等［21］的研究結(jié)果表明，解凍前平衡10～30 min對印度鲃Mahseer精子的凍存效果沒有影響。魯大椿等［22］認(rèn)為，對魚類精子低溫冷凍保存時，平衡時間應(yīng)為10～30 min。本研究結(jié)果表明，將中間球海膽精子與冷凍保護(hù)液混合后，當(dāng)平衡時間為15 min時，其冷凍效果較好。

3.4 添加葡萄糖對冷凍后精子受精率的影響

精子的受精率與精子的活力密切相關(guān)。要得到高的受精率，精子必須具有較強(qiáng)的活力［23］。有研究發(fā)現(xiàn)，外源性葡萄糖能被精子利用，增強(qiáng)精子的活力，延長精子的壽命［23-25］。Urner等［26］研究表明，缺乏葡萄糖會阻礙小鼠精子進(jìn)入卵中，進(jìn)而影響精子與卵的融合。精子被激活后，由于精子運(yùn)動和維持精細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡均需要消耗能量，這也是冷凍后精子受精率下降的原因之一。本研究中發(fā)現(xiàn):精子被解凍后在進(jìn)行受精時，在受精海水中添加適量的葡萄糖可以提高精子的受精率，葡萄糖濃度為56 mmol/L時其效果最好;但添加的葡萄糖濃度過高或過低時，都不利于精子受精。

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