檸檬黃蠟傘的抑菌活性及石油醚層成分分析

高文彬，張雅梅，宋學洲，田 野，程 鴻，包海鷹*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院菌物研究所，吉林 長春 130118；2.吉林大學植物科學學院，吉林 長春 130062）

檸檬黃蠟傘 （Hygrophorus lucorum Kalchbr）[1]，別名檸檬蠟傘[2]，俗稱黃油蘑[3]、小黃蘑，屬真菌門（Eumycota）、擔 子 菌 亞 門 （Basidiomycotina）、層 菌 綱 （Hymenomycetes）、傘菌目 （Agaricales）、蠟傘科 （Hygrophoraeae）。檸檬黃蠟傘群生或散生于針葉林或針闊混交林地上，在吉林省長白山地區(qū)[4]、燕山地區(qū)[5]和內(nèi)蒙古阿爾山地區(qū)[6]廣為分布。該菌味道好，干品色澤金黃，民間多用干品燉雞來滋補身體。檸檬黃蠟傘化學成分國內(nèi)外均未見報道，生理活性也只有抗氧化活性的報道[5]。對檸檬黃蠟傘子實體提取物的抑菌活性以及石油醚層化學成分進行研究，證明其可以代謝產(chǎn)生具有抗菌作用的活性成分，為下一步的活性化合物研究以及合理開發(fā)利用這一天然菌物資源提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥材

檸檬黃蠟傘子實體（干品） 購自阿爾山地區(qū)（2010年產(chǎn)）；經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學，菌物研究所圖力古爾老師鑒定為檸檬黃蠟傘（Hygrophorus lucorum Kalchbr）。

1.1.2 供試菌種

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、沙門氏菌（Salmonella enterica）、鏈球菌 （Streptococcus）、大腸桿菌(Escherichia coli)，以上菌種由吉林大學畜牧獸醫(yī)學院惠贈。玉米灰斑病菌（Cercospora zeae-maydis）、玉米紋枯病菌（Rhizopus spp.）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosparioides）、甘薯黑斑病菌 （Ceratocystis fimbriata）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、禾鐮刀菌（Fusarium graminearum）由吉林大學植物科學學院惠贈。

1.1.3 供試陽性藥

阿米卡星注射液，批號110905，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司；硫酸慶大霉素注射液，批號110902，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司；氯霉素注射液，批號1106092，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司；頭孢曲松鈉注射液，批號110432076，蘇州東瑞制藥有限公司；硝酸咪康唑乳膏，批號110404j，深圳三九藥業(yè)。以上藥品均購自長春市吉林大藥房。

1.1.4 試劑

環(huán)己烷，分析純，汕頭市西隴化工有限公司；石油醚（30℃~60℃）、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇，分析純，天津化學試劑有限公司。

1.1.5 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（酵母粉0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%，pH為7.4）；LBA培養(yǎng)基（酵母粉0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、瓊脂1.8%，pH為7.4）；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%）。

1.1.6 菌株培養(yǎng)

細菌無菌條件下，以移液槍吸取0.01 mL菌種于LB培養(yǎng)基內(nèi)，密封并輕輕搖勻，置37℃搖床（轉(zhuǎn)速200r·min-1）中培養(yǎng)10 h~18 h。真菌無菌條件下，將菌種接在PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，封口，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h~96 h。

1.1.7 設(shè)備

氣質(zhì)聯(lián)用儀為Agilent6890N型GC和Agilent5973IMSD型MS并配有NIST5圖譜系統(tǒng)；Finnigan-MAT.LCQ型的電噴霧質(zhì)譜儀；BrukerAM-400LBz型核磁共振波譜儀；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，HH·CP-01W；凍干機，F(xiàn)DU-1200。

1.2 檸檬黃蠟傘提取物的制備

將檸檬黃蠟傘實體3 000 g，25℃烘干，粉碎，甲醇室溫提取3次，每次12 h，每小時攪拌1次，合并提取液，減壓濃縮得到提取物，加水懸浮，分別用石油醚（60℃~90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，萃取液減壓濃縮得到各部分萃取物，低溫保存。

1.3 受試樣品的制備

取各提取物，凍干機冷凍干燥，密封，低溫保存。用前倍半法稀釋：50 mg·mL-1、25 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、3.025 mg·mL-1、1.5125 mg·mL-1；空白組：相應的溶劑。

1.4 供試陽性藥的制備

硫酸阿米卡星注射液（1.0 mg·mL-1）：無菌條件下，精確吸取硫酸阿米卡星注射液1.0 mL于100 mL無菌容量瓶中，以pH 7.8的磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容。密封后冷藏保存。慶大霉素（1.0 mg·mL-1）：無菌條件下，精確吸取硫酸慶大霉素注射液1.0 mL于200 mL無菌容量瓶中，以pH 7.8的磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容。氯霉素（1.00 mg·mL-1）：無菌條件下，精確吸取氯霉素注射液0.8 mL于100 mL無菌容量瓶中，以pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容。密封后冷藏保存。頭孢曲松鈉（1.0 mg·mL-1）：無菌條件下，精確稱取注射用頭孢曲松鈉0.1 g于100 mL無菌容量瓶中，以pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容。密封后冷藏保存。

1.5 抑菌試驗

采用紙片擴散法測定[7]，無菌條件下，取直徑為7.0 mm的圓形濾紙片蘸取供試溶液（完全浸透且無液滴滴落），在超凈工作臺中吹干后將該濾紙片均勻擺放在涂有細菌菌懸液的培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿中均勻擺放6個紙片，分別為供試藥、陽性藥和陰性對照，重復3次。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h~18 h后，采用十字交叉法測量抑菌直徑。真菌是在無菌條件下用7.0 mm打孔器將長滿菌絲體的培養(yǎng)皿打孔，將菌餅接到PDA培養(yǎng)基上每個培養(yǎng)皿中均勻擺放4個紙片是供試藥，重復3次，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h~72 h后，采用十字交叉法測量抑菌直徑。

1.6 最低抑菌濃度（MIC） 測定

采用試管二倍稀釋法測定[8]，使用LB液體培養(yǎng)基（2 mL·管-1）將藥物對倍稀釋成系列濃度，每個濃度3個復管，然后加入0.1 mL菌液。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以混濁度為指標檢查該管中有無細菌生長，眼觀選出不顯示混濁試管，分別取其液體涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)37℃，24 h，觀察結(jié)果。瓊脂平板上無細菌生長而含藥液濃度最低者，即為該種藥物對該菌株的最低抑菌濃度。

1.7 結(jié)果計算

以抑菌圈直徑（mm）、抑菌率（%） 來評定藥物的抑菌作用。抑菌率（P）的計算公式如下[8]：

式中：R1表示供試樣品抑菌圈直徑；R2表示濾紙片直徑；R3表示陽性藥抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性藥的篩選

根據(jù)實驗需要，陽性藥的抑菌圈直徑不宜過大，否則抑菌圈會覆蓋至相鄰紙片上，或者2個相鄰抑菌圈相連，從而影響測量準確度；陽性藥抑菌圈直徑過小，則會影響實驗時的準確度，使誤差變大。結(jié)果見表1。

表1 不同陽性藥的抑菌圈直徑

結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、鏈球菌、大腸桿菌的最佳陽性藥為阿米卡星（1.00 mg·mL-1）。

2.2 檸檬黃蠟傘子實體提取物的抑菌作用

檸檬黃蠟傘子實體提取物的抑菌結(jié)果見表2。

檸檬黃蠟傘石油醚相、乙酸乙酯相對所選9種真菌均無明顯抑制作用，對4種細菌沙門氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有較好的抑制作用，正丁醇層和水層均無效果，乙酸乙酯層提取物的抑制作用最好，在濃度是50 mg·mL-1時抑菌率最高，分別是55.08%、42.97%、61.10%和50.08%（表2）。石油醚層提取物對4種菌的MIC 值分別為 3.125 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、3.125 mg·mL-1和3.125 mg·mL-1。乙酸乙酯層提取物對4種菌的MIC值均為 3.125 mg·mL-1。

表2 檸檬黃蠟傘子實體提取物對的抑菌效應

2.3 檸檬黃蠟傘石油醚層化學成分

石油醚層的GC-MS分析，其GC-MS總離子流色譜圖如圖1所示。采用WIKEY.L圖譜檢索，并結(jié)合質(zhì)譜圖中基峰、負荷比以及相對豐度與標準譜圖的比較，在石油醚層中鑒定出個5化合物，結(jié)果見表3。

圖1 檸檬黃蠟傘揮發(fā)油GC-MS總離子流圖

3 討論

近年來，從真菌中發(fā)現(xiàn)了大量結(jié)構(gòu)新穎且具有生理活性的物質(zhì)，根據(jù)真菌的生理特性，不僅可以直接利用子實體，而且還可以利用菌絲體或孢子進行發(fā)酵培養(yǎng)大量繁殖。這對于現(xiàn)代藥物、食品防腐以及農(nóng)藥先導化合物的發(fā)現(xiàn)和工業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要。我國真菌資源豐富，許多學者對這一資源進行考察發(fā)掘，一些新的有藥用價值的真菌已被進行深入地研究并投入生產(chǎn)，但是從總體上來說該學科發(fā)展還是較慢，直至2010年版藥典收載的有藥用的真菌類只有7種[9]。因此，以真菌為原料，進行活性篩選，對活性成分跟蹤分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，利用液體發(fā)酵技術(shù)定向大量生產(chǎn)活性成分，對新藥的開發(fā)和利用具有十分重要的意義。本文對檸檬黃蠟傘不同提取部位的抑菌活性進行了初步研究，結(jié)果表明，檸檬黃蠟傘子實體的提取物對所選的9種真菌均無明顯抑制作用，Gianluca Gilardoni從同科的金粒蠟傘（Hygrophorus chrysodon）新鮮子實體中分離得到 2個 2-?；h(huán)戊烯-1，3-二酮衍生物，chrysotrione A和B，對植物病原菌輪枝樣鐮孢菌（Fusarium verticillioides）具有抑制作用[10]，本實驗檸檬黃蠟傘子實體粗提物對所選的植物病原菌并沒有明顯的抑制作用，可能是在粗提物中抑菌活性物質(zhì)含量太低，并未表現(xiàn)抑菌活性，下一步將擴大篩選范圍，尋找特異的靶標真菌。石油醚層和乙酸乙酯層對所選細菌均有有較好的抑制作用，下一步對其抑菌活性成分進行跟蹤分離和結(jié)構(gòu)研究，同時對其液體發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，為進一步的基于活性物質(zhì)為基礎(chǔ)的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。Bertrand Veau從青黃蠟傘（Hygrophorus hypothejus） 分離出 lectin（HHL） 具有凝血的作用[11]。Norman Mier報道金粒蠟傘 （Hygrophorus chrysodon） 和金黃擬蠟傘 （Hygrophoropsis aurantiaca） 對果蠅幼蟲有毒殺作用[12]。Antonella Del Signore分析了淺黃褐色蠟傘 （Hygrophorus leucophaeus） 中的總酚含量為4.15%[13]，熊偉從淡紅蠟傘菌（Hygrophorus russula Fr.）提取出多糖，多糖得率為6.52%[14]，多酚和多糖具有多種生理活性，本課題組將對檸檬黃蠟傘的化學成分就行全面的分析，探究其是否具有其他的生理活性，為更好的利用這一真菌資源提供理論依據(jù)。

表3 檸檬黃蠟傘子實體石油醚成分的氣質(zhì)聯(lián)機分析結(jié)果

[1]戴玉成，周麗偉，楊祝良，等.中國食用菌名錄[J].菌物學報，2010，29(1)：1-21.

[2]計紅芳，張令文，張磊，等.檸檬蠟傘多糖的提取工藝研究[J].河南科技學院學報，2011，39(4)：20-27.

[3]楊丈勝，王建國.內(nèi)蒙古森林食用菌及其開發(fā)利用[J].內(nèi)蒙古林業(yè)，1991(5)：16-17.

[4]周繇.長白山區(qū)野生食用真菌資源調(diào)查研究及其開發(fā)利用[J].中國食用菌，2002，22(1)：8-10.

[5]孫紅.河北省燕山地區(qū)野生高等真菌資源調(diào)查及五種子實體抗氧化活性研究[D].河北師范大學碩士論文，2010.

[6]萬宇，圖力古爾，李玉.內(nèi)蒙古阿爾山地區(qū)大型真菌物種多樣性研究[J].菌物研究，2009，7(2)：76-85.

[7]佟春蘭，包海鷹，圖力古爾.蒙古口蘑子實體石油醚提取物的化學成分及抑菌活性[J].菌物學報，2010，29(4)：619-624.

[8]游洋，包海鷹.不同成熟期大禿馬勃子實體提取物的抑菌活性及其揮發(fā)油成分分析[J].菌物學報，2011，30(3)：477-485.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[10]Gianluca Gilardoni,Marco Clericuzio,Solveig Tosi,et al.Antifungal Acylcyclopentenediones from fruiting bodies of Hygrophorus chrysodon[J].J.Nat.Prod.,2007(70):137-139.

[11]Bertrand Veau,Jean Guillot,Mireille Damez,et al.Purification and characterization of an anti-(A+B)specic lectin from the mushroom Hygrophorus hypothejus[J].Biochimica et Biophysica Acta,1999(1428):39-44.

[12]Norman Mier,Sandrine Canete,Alain Klaebe,et al.Insecticidal properties of mushroom and toadstool carpophoresI[J].Phytochemrstry,1996 41(5):1293-1299.

[13]Antonella Del Signore,Francesco Romeo,Mario Giaccio.Content of phenolic substances in basidiomycetes[J].Mycol.Res.,1997,101(5):552-556.

[14]熊偉，張涪平，鐘國輝，等.西藏淡紅蠟傘菌多糖的提取及單糖組成研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1997，33(10)：171-174.