沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性及機(jī)制研究

盧 曉，周 磊，謝鯤鵬，景宜人，云寶儀，汪業(yè)菊，謝明杰

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116081）

沒(méi)食子酸又名五倍子酸、桔酸，化學(xué)名3，4，5一三羥基苯甲酸，為白色或淡黃色針狀結(jié)晶或粉末，通常是以一水合物的形式存在，廣泛存在于黃櫨葉、漆樹(shù)葉、茶條槭葉等植物的葉片中，是一種重要的有機(jī)原料，廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品、染料、輕工及電子等行業(yè)[1-3]。已有的研究表明，沒(méi)食子酸具有一定的抗腫瘤，抗乙肝病毒的功效和較強(qiáng)的抗氧化、抗自由基作用[4-6]。此外，沒(méi)食子酸也對(duì)厭氧菌微生物、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、干燥棒狀桿菌和藤黃微球菌、綠膿桿菌有抑制作用[7-8]。目前關(guān)于沒(méi)食子酸的抑菌作用機(jī)制尚不清楚。因此本文以金黃色葡萄球菌為供試菌，通過(guò)對(duì)其細(xì)胞膜的通透性、蛋白質(zhì)含量變化等方面來(lái)研究沒(méi)食子酸的抑菌機(jī)制，旨在為開(kāi)發(fā)高效低毒的抗菌藥物和新型天然防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種為金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ATCC26112），購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 （Nutrient broth medium，簡(jiǎn)稱(chēng)NB）。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于大連檢驗(yàn)檢疫局；

主要儀器設(shè)備為YY0027-90型電熱恒溫培養(yǎng)；DDS-307A(DDB-600)型電導(dǎo)率儀；電泳凝膠定量分析系統(tǒng)（TRANSILLUMZNATOR 2020D）；SP-DJ系列垂直凈化工作臺(tái)；HZQ-F160全溫度振蕩培養(yǎng)箱；DGG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；UV-7504紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 最低抑菌濃度的測(cè)驗(yàn) [9]

本試驗(yàn)采用杯碟法。首先在培養(yǎng)皿內(nèi)注入20 mL 2%的固體培養(yǎng)基作為底層，凝固后再在平板中倒入5 mL加有0.1 mL供試菌的1%的半固體培養(yǎng)基。待凝后在其上等距離分散地輕輕放上無(wú)菌牛津杯內(nèi)徑 （6±0.1）mm，外徑（8±0.1） mm，高 （10±0.1） mm，在杯內(nèi)分別注入 0.2 mL濃度為8 mg·mL-1的沒(méi)食子酸，以無(wú)水乙醇作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。37℃下培養(yǎng)24 h后用卡尺測(cè)定抑菌圈直徑,取其平均值。

1.3 沒(méi)食子酸最低抑菌濃度 （MIC）的測(cè)定 [10]

將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期 （濃度為106 cfu·mL-1~107 cfu·mL-1）后，向96孔板中加入100 μL菌懸液、10 μL不同濃度的沒(méi)食子酸，然后放入37℃，100 r·min-1搖床中培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入20 μL0.2%2,3,5-氯化三苯基四氮唑 (TTC)，37℃，100 r·min-1避光培養(yǎng)4h后，觀察其顏色變化，以無(wú)水乙醇為對(duì)照組。

1.4 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的繪制 [11]

將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按2%接種量加入到含0.2 mg·mL-1沒(méi)食子酸的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，放入37℃，120 r·min-1搖床培養(yǎng)，在0 h~52 h中每4 h取樣一次，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為580 nm下測(cè)定其OD值，加入等量無(wú)水乙醇為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。繪制沒(méi)食子酸作用后金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線。

1.5 培養(yǎng)液電導(dǎo)率的測(cè)定 [12]

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，加入沒(méi)食子酸（終濃度為0.05 mg·mL-1）后繼續(xù)培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)至1 h、 2 h、 3 h、4 h、 5 h、 6 h、7 h和 8 h的培養(yǎng)液 1 mL，4000 r·min-1離心 10 min，將上清液稀釋 20倍后，用DDS-307A(DDB-600)型電導(dǎo)儀測(cè)定其電導(dǎo)率。以無(wú)水乙醇為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 培養(yǎng)液中DNA、RNA等大分子物質(zhì)的測(cè)定

收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，用PBS緩沖液洗滌2次后制成一定濃度的菌懸液，然后加入沒(méi)食子酸使其終濃度為 0.05 mg·mL-1。 待藥物作用 0、2 h、4 h、6 h和8 h時(shí)取樣液 4 mL，4 000 r·min-1離心10 min，用紫外分光光度計(jì)于260 nm下測(cè)定上清液中DNA、RNA等大分子物質(zhì)的吸光值。以不加藥組為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 金黃色葡萄球菌可溶性蛋白含量的測(cè)定

向培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌的菌液中加入沒(méi)食子酸，使培養(yǎng)液中沒(méi)食子酸的終濃度為0.05 mg·mL-1，分別在16 h和20 h時(shí)取菌懸液，5 000 r·min-1離心10 min，收集菌體50 mg，用20 μL的無(wú)菌水將菌體混勻，按1∶4的體積比加入緩沖溶液，混勻，然后在沸水浴中煮沸5 min，5 000 r·min-1離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以不加藥組為對(duì)照組。

2 結(jié)果和分析

2.1 沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性和最低抑菌濃度 （MIC）的測(cè)定結(jié)果

牛津杯法測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌有較高的抑制作用，其抑菌圈直徑為13 mm。沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。TTC是一種實(shí)驗(yàn)室常用的活菌染料，該染料進(jìn)入細(xì)胞后，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶能把TTC還原成紅色的甲瓚（Formazan），使培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，而死細(xì)胞則為無(wú)色。由表可知，經(jīng)TTC染色后，培養(yǎng)基的顏色隨沒(méi)食子酸濃度的增加而變淺，即由紅色變至無(wú)色。說(shuō)明沒(méi)食子酸能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，且其抑制作用隨藥物濃度的增加呈正相關(guān)。當(dāng)沒(méi)食子酸的濃度大于0.01 mg·mL-1時(shí)，可完全抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌的 MIC 為 0.01 mg·mL-1。

Table 1 The mensuration result of MIC of Gallic acid against Staphylococcus aureus

2.2 沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響結(jié)果見(jiàn)Fig.1。由圖可知，沒(méi)食子酸組中的金黃色葡萄球菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期明顯被抑制，4 h的抑制率最高為70.57%。48h時(shí)細(xì)菌濃度最高，但OD值為2.745，比對(duì)照組小4%，隨即二者均進(jìn)入衰亡期，從圖中可以看出，在24 h之前，沒(méi)食子酸嚴(yán)重的抑制了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，在進(jìn)入衰亡期后，如在從50 h~52 h的時(shí)間段里，受到?jīng)]食子酸的影響，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的衰亡速度快了83.3%。

2.3 沒(méi)食子酸作用金黃色葡萄球菌后培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化

沒(méi)食子酸作用金黃色葡萄球菌后培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化的測(cè)定結(jié)果顯示 （Fig.2），結(jié)果說(shuō)明沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性有影響。細(xì)胞膜通透性的改變會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鉀離子、鈉離子等小分子物質(zhì)的外漏，從而導(dǎo)致胞外電導(dǎo)率的變化。電導(dǎo)率的改變可以反映細(xì)胞膜滲透性的改變。本研究的測(cè)定結(jié)果顯示如圖，沒(méi)食子酸作用金黃色葡萄球菌菌體初期，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。當(dāng)藥物作用5h時(shí)，沒(méi)食子酸組的電導(dǎo)率與對(duì)照組相比增加了6.38% （P<0.05）。結(jié)果說(shuō)明沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性有影響。

Fig.1 Effect of Gallic acid on the growth curve of Staphylococcus aureus

Fig.2 The change about conductivity from Staphylococcus aureus effected by Gallic acid

2.4 沒(méi)食子酸作用金黃色葡萄球菌后培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值的變化

沒(méi)食子酸作用金黃色葡萄球菌后培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值的變化結(jié)果見(jiàn)Fig.3。本實(shí)驗(yàn)對(duì)加藥后大分子物質(zhì)的外漏量進(jìn)行了測(cè)定。因?yàn)镈NA、RNA等這些大分子物質(zhì)在260nm處有較強(qiáng)的吸收值，所以通過(guò)測(cè)定OD260nm的變化可推測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響。沒(méi)食子酸作用菌體初期，大分子的吸光值隨著作用時(shí)間的增加而逐漸增大，當(dāng)培養(yǎng)至8h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大分子物質(zhì)吸光值的變化率達(dá)到最大，比對(duì)照組增加74.4% （P<0.05）。通過(guò)測(cè)定OD260nm的變化可推測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響。表明菌體細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA等大分子物質(zhì)發(fā)生滲漏，菌體的細(xì)胞膜受到破壞。

2.5 沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌可溶性蛋白的影響

Fig.3 The change about OD of large molecules from Staphylococ cus aureus effected by Gallic acid

Fig.4 The soluble protein of Staphylococcus aureus by Gallic acid M：marker； 1：control group； 2：Gallic acid 20h group

沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌可溶性蛋白的影響見(jiàn)圖4。利用Gel-Pro Analyzer蛋白分析軟件對(duì)沒(méi)食子酸作用金黃色葡萄球菌的SDS-PAGE蛋白譜帶定量分析結(jié)果表明，沒(méi)食子酸可明顯的抑制金黃色葡萄球菌胞可溶性蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比，沒(méi)食子酸作用20h后的金黃色葡萄球菌總蛋白量沒(méi)有明顯變化 （Fig.4），其原因可能是沒(méi)食子酸并沒(méi)有影響了金黃色葡萄球菌核酸的合成和相關(guān)基因的表達(dá)。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)利用牛津杯法對(duì)沒(méi)食子酸的抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示沒(méi)食子酸在不同濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌效果；通過(guò)利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色的方法測(cè)定沒(méi)食子酸的最低抑菌濃度為8mg·mL-1，并且在一定濃度范圍內(nèi)，沒(méi)食子酸的抑菌作用隨著濃度的升高而增強(qiáng)。

已有的研究結(jié)果表明，藥物的抑菌機(jī)制主要是通過(guò)破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性、抑制蛋白、核酸的合成等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸在作用菌體初期使金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率增加，且胞內(nèi)DNA、RNA等大分子物質(zhì)有明顯外漏，說(shuō)明沒(méi)食子酸能引起金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜滲透性的改變，且破壞細(xì)胞膜的完整性。究其原因，可能是沒(méi)食子酸取物誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生了某些降解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的酶所致，或者是藥物與菌體細(xì)胞膜接合，改變了細(xì)胞膜的通透性，使胞質(zhì)外滲。

利用Gel-Pro Analyzer蛋白分析軟件對(duì)沒(méi)食子酸作用金黃色葡萄球菌SDS-PAGE蛋白譜帶定量分析結(jié)果表明，沒(méi)食子酸可明顯的抑制金黃色葡萄球菌胞可溶性蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比，沒(méi)食子酸作用20h后的金黃色葡萄球菌總蛋白量沒(méi)有明顯變化，其原因可能是沒(méi)食子酸并沒(méi)有影響了金黃色葡萄球菌核酸的合成和相關(guān)基因的表達(dá)，具體原因還有待進(jìn)一步的探究。

綜上所述，沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌活性，其抑菌機(jī)制是通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性以及抑制菌體蛋白質(zhì)的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但其具體的抑菌機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。希望本文的研究?jī)?nèi)容為進(jìn)一步研究沒(méi)食子酸的抑菌機(jī)制和開(kāi)發(fā)高效低毒的抗菌藥物提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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