基于rDNA-ITS序列對(duì)金針菇系統(tǒng)發(fā)育分析*

金 華，鄒吉祥，宋春鳳，李長田，樸仁哲**

（1.大連民族學(xué)院，遼寧大連，116600；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉，133000；

3.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連，116622；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春，130118）

金針菇 （Flammulina velutiper）又名毛柄小火菇、構(gòu)菌、樸菇、冬菇、樸菰、凍菌、金菇、智力菇等，隸屬真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口磨科，金錢菌屬[1]。金針菇是中國主要栽培食用菌之一，分為黃色和白色2大品系[2-3]，有表現(xiàn)野生型的黃褐色菌株，突變的純白菌株和一系列中間顏色的淺黃菌株[4]。金針菇味道鮮美,營養(yǎng)豐富 ,是著名的食藥兩用菌，有 “益智菇 ”等美稱 ,具有很高的開發(fā)價(jià)值和廣闊的前景[5]。它廣泛分布于中國、日本、俄羅斯、歐洲、北美洲、澳大利亞等地均有分布。在中國北起黑龍江，南至云南，東起江蘇，西至新疆均適合金針菇的生長[6]。ITS序列是真菌基因組rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，位于18S和5.8S rDNA以及5.8S和28S rDNA之間，在物種屬內(nèi)、近緣屬間乃至科內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究中有一定的價(jià)值[7]。ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[8]。目前國內(nèi)外對(duì)利用ITS序列分析鑒定金針菇的研究報(bào)道較少，本研究通過真菌核糖體ITS1和ITS4通用引物對(duì)不同品種、不同來源的金針菇材料PCR擴(kuò)增，進(jìn)行ITS序列分析，并通過在GenBank中的金針菇ITS序列進(jìn)行比較，旨在從分子水平上鑒定金針菇親緣關(guān)系，為金針菇菌株的區(qū)分鑒定、遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供技術(shù)依據(jù)。

表1 供試材料編號(hào)及產(chǎn)地

1 材料與方法：

1.1 材料

所用材料為河南駐馬店市金針菇和吉林延吉地區(qū)的金針、金白、日金三個(gè)金針菇樣品，將各金針菇樣品ITS序列提交NCBI，并獲得登錄號(hào)，另有5個(gè)金針菇的ITS序列來自GenBank。

1.2 方法：

1.2.1 DNA提取：

采用改良的SDS法提取DNA將提取的DNA，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增ITS區(qū)段：

采用真菌 ITS序列的通用引物ITS1（5′-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（ 5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：用 25μl PCR 反應(yīng)體系：2.5μl 10×PCR buffer(Mg2+)、 2μl dNTP(各 2.5 mmol·L-1)、 引物分別加入 0.5μl(10 μl·L-1)、0.5μl Taq DNA 聚合酶 (5U·μl-1)、 0.5μl DNA 模板，用水補(bǔ)至25 μl。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性40 s秒，52℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃保溫5 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 ITS區(qū)段克隆及測(cè)序：

將擴(kuò)增出來的核酸片段在上海生物工程公司純化后測(cè)序。其中吉林省延吉市的3個(gè)金針菇樣品測(cè)序圖重疊峰嚴(yán)重，為查明原因，通過上海生物工程公司克隆測(cè)序，每個(gè)樣品測(cè)6個(gè)克隆。

1.2.4 ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：

將測(cè)序結(jié)果通過ClustalVersion2.1軟件、BLAST工具和DNAMAN軟件配合手動(dòng)排序，分析G+C含量和變異位點(diǎn)，并在GenBank注冊(cè)，所得序列號(hào)見表1。利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析比對(duì)分析，并以自展法 (boot strap)進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán)1 000次，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (Neighbor joining tree)。使用MEGA5.0中的Maxi mum Composite Likelihood模型構(gòu)建序列遺傳距離矩陣。

2 結(jié)果與分析：

2.1 ITS序列長度與GC含量分析：

所有供試材料ITS總長度在712-719bp范圍內(nèi) (見表1)，G+C含量為49.4%~49.9%。其中ITS1在244 bp~249 bp范圍內(nèi)，G+C含量為47.2%~48.0%；ITS2在308 bp~311 bp范圍內(nèi)，G+C含量為52.1%~53.6%。5.8S rDNA進(jìn)化過程中高度保守[8，12~14]，所以不做分析。分析表明，金針菇ITS區(qū)G+C含量變化較小，ITS2的長度和G+C含量均大于ITS1。

2.2 ITS序列突變位點(diǎn)分析：

對(duì)吉林地區(qū)金針菇樣品的測(cè)序圖進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)重疊峰嚴(yán)重，在ITS序列中存在堿基的插入或缺失的情況。為研究堿基的變異情況，對(duì)樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析。分析表明，吉林地區(qū)金針菇共有13個(gè)突變位點(diǎn)，其中，樣品1、樣品2、樣品3的突變位點(diǎn)分別為：8個(gè)、8個(gè)、11個(gè)，說明其序列均沒有同步進(jìn)化，而其他六個(gè)金針菇樣品各自進(jìn)化比較穩(wěn)定。

2.3 ITS排序及序列位點(diǎn)的分析：

通過clustalx1.83對(duì)序列進(jìn)行排序，結(jié)果所有序列共有35個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，其中可用于分析的信息位點(diǎn)13個(gè)，ITS1區(qū)有8個(gè)，ITS2區(qū)有5個(gè) (見表3)。

ITS區(qū)共有變異位點(diǎn)35個(gè)；信息位點(diǎn)13個(gè)，占總變異位點(diǎn)的37.14%。其中ITS1有21個(gè)變異位點(diǎn)，8個(gè)變異信息位點(diǎn)，占總變異信息位點(diǎn)的61.54%，ITS2有13個(gè)變異位點(diǎn)，5個(gè)變異信息位點(diǎn)，占總變異信息位點(diǎn)的38.46%。ITS2的變異信息位點(diǎn)數(shù)高于ITS1。

堿基變異類型有C-T和G-A轉(zhuǎn)換，C-A顛換，缺失變異，T→C轉(zhuǎn)換5個(gè)，占38.46%；A→G轉(zhuǎn)換有2個(gè)，占15.38%；C→A顛換1個(gè)，占7.69%；有5個(gè)缺失位點(diǎn)占38.46%，說明堿基變異類型以轉(zhuǎn)換為主。

2.4 金針菇ITS序列遺傳距離分析：

采用MEGA5.0根據(jù)Maximum Composite Likelihood參數(shù)分析得到序列間遺傳距離 (見表3)。9個(gè)金針菇樣品的平均距離為0.005。遺傳距離最大為0.014，樣品1、樣品2、樣品 3、樣品 4、樣品 5之間的遺傳距離最小，為0.000，說明它們的ITS序列為同源序列。其余樣品遺傳距離均小于0.1，說明它們親緣關(guān)系較近，表示其遺傳分化可能發(fā)生很晚或者種群間的基因流動(dòng)發(fā)生頻繁。

表2 吉林地區(qū)3個(gè)金針菇材料ITS序列突變位點(diǎn)的比較

表3 供試材料ITS的變異信息位點(diǎn)

表4 基于rDNA-ITS序列的遺傳距離比較

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，用靴帶自展法 （Bootstrap）檢驗(yàn)發(fā)育樹，重復(fù)1000次，判斷各分支處的可信度 (圖1)。廣東省廣州市與其他樣品處于樹的兩大分支上，說明ITS序列可用于鑒別金針菇的親緣關(guān)系，其余8個(gè)樣品中，吉林省延吉市 （金針）、吉林省延吉市 （金白）、吉林省延吉市 （日金）、河南省駐馬店市、遼寧省大連市的金針菇樣品在樹的最小分支上，得到了Bootstrap值的有力支持 (57%)，表明這五個(gè)地區(qū)的金針菇在ITS區(qū)極其相似，但不能通過ITS序列區(qū)分吉林延吉地區(qū)的3個(gè)金針菇品種。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建九個(gè)金針菇材料的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

在進(jìn)化過程中ITS序列所受到的選擇壓力非常小，能夠允許更多的變異，進(jìn)化速率較快，在大部分的真核生物中都表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，能夠顯示種群內(nèi)最近的進(jìn)化特征[9]，且ITS序列分析受主觀因素的影響較小[10]。ITS區(qū)序列已經(jīng)應(yīng)用于真菌中很多屬種的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化的研究，在揭示分布于不同區(qū)域的或間斷分布種群的關(guān)系具有更大的潛力[11]。目前ITS序列對(duì)金針菇系統(tǒng)發(fā)育的研究較少，本文采用不同地區(qū)金針菇以及不同品種的金針菇為材料進(jìn)行ITS序列分析，并與GenBank上的金針菇序列比較，發(fā)現(xiàn)ITS序列變異信息豐富，且主要集中在ITS2區(qū)域上，其中延邊地區(qū)三個(gè)金針菇樣品ITS序列重疊峰嚴(yán)重，通過克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)各品種間進(jìn)化不同步[12]，ITS序列上正在發(fā)生變異，尚未形成顯著差異，這可能是導(dǎo)致無法用ITS序列區(qū)分延邊地區(qū)金針菇屬3個(gè)品種的原因。根據(jù)NJ系統(tǒng)發(fā)育樹判斷，廣東省廣州市的樣品與其他樣品處于樹的兩大分支上，其余樣品之間又出現(xiàn)很多分支，河南地區(qū)、遼寧地區(qū)和延邊地區(qū)的3個(gè)金針菇樣品處于同一個(gè)最小分支上，說明這3個(gè)地區(qū)的金針菇親緣關(guān)系較近，可見，ITS序列能夠鑒定金針菇的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。不同地區(qū)的環(huán)境差異對(duì)金針菇屬的變異影響較大，其中某些地區(qū)金針菇屬種類的ITS區(qū)變異較晚，單純用ITS序列無法對(duì)所有金針菇種類進(jìn)行有效的分類鑒定。ITS區(qū)變異豐富，對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行序列分析不僅豐富了真核生物核糖體基因ITS序列信息，而且為真菌分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供了十分重要的資料和依據(jù)[13]，從而成為系統(tǒng)與進(jìn)化研究中重要的分子標(biāo)記，本研究也為將來的真菌親緣關(guān)系分析提供了重要的理論依據(jù)。

然而以ITS序列作為分子標(biāo)記應(yīng)用技術(shù)的最大限制是，有的真菌由于進(jìn)化順序、變異、甚至分析方法等原因，在間隔區(qū)表現(xiàn)的差異性比較小，不適于屬內(nèi)種及種群的標(biāo)記，這就得依賴于其他基因序列的有力補(bǔ)充。相信隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，采用分子方法進(jìn)行物種間分類、鑒定、親緣關(guān)系的確定會(huì)更加精確。

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