野生靈芝菌種培養(yǎng)基篩選的研究*

袁學(xué)軍，李艷麗，陳永敢，張 恒

（瓊州學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，海南 三亞 572000）

靈芝 (Ganoderma lucidum)隸屬真菌門 (Eumycota)，擔(dān)子菌亞門 (Basidiomycotina)，層擔(dān)子菌綱 （Hymeno mycetes）,無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱 (Holobasidiomycetidae)，非褶菌目 (Aphyllophorales)[1]。靈芝主要分布在亞洲、澳洲、非洲及美洲的熱帶及亞熱帶，少數(shù)分布于溫帶。地處北半球溫帶的歐洲僅有靈芝屬的4種，而北美洲大約5種。我國(guó)地跨熱帶至寒溫帶，靈芝科種類多而分布廣[2]。海南島地處北半球熱帶區(qū)，其豐富的水熱資源和復(fù)雜的地形條件，有利于靈芝真菌的生長(zhǎng)繁殖，這就決定了海南島靈芝資源是國(guó)內(nèi)外最豐富的地區(qū)，在我國(guó)靈芝在海南的分布種類最多，計(jì)78種,分屬4屬、3亞屬、2個(gè)組[3]，占全國(guó)靈芝科的53.6%[2]。

靈芝的生物活性成分十分豐富，豐富的生物活性成分決定了它功能的多樣性[4]。據(jù)有關(guān)研究表明，目前已分離到靈芝的150余種活性成分，有多糖類、核苷類、生物堿類、氨基酸、蛋白質(zhì)類、三萜類和礦質(zhì)元素等[5]，具有抗腫瘤、保肝解毒、預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病、抗過(guò)敏、抗衰老、抗神經(jīng)衰弱、治療高血壓、慢性支氣管炎、支氣管哮喘等作用[6]。除醫(yī)學(xué)外，靈芝在食品、飲品以及保健品產(chǎn)業(yè)都占有一定的市場(chǎng)與地位，具有較高的觀賞價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7]。靈芝既不同于一般藥物對(duì)某種疾病起治療作用，亦不同于一般營(yíng)養(yǎng)保健食品只對(duì)某一方面營(yíng)養(yǎng)素的不足進(jìn)行補(bǔ)充和強(qiáng)化，它的獨(dú)特之處主要在于它是在整體上雙向調(diào)節(jié)人體機(jī)能平衡，調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)部活力，調(diào)節(jié)人體新陳代謝，提高自身免疫能力，促使全部的內(nèi)臟或器官機(jī)能正常化，從而從根本上達(dá)到治病強(qiáng)身保健的目的[6]。

近年來(lái)，靈芝的開(kāi)發(fā)利用越來(lái)越受到人們的重視，消費(fèi)量增長(zhǎng)很快，種植面積不斷擴(kuò)大，但存在著菌種成活率低、發(fā)菌慢、結(jié)皮老化、出芝表面木栓化、生物轉(zhuǎn)化率低、成本高、質(zhì)量不穩(wěn)定等現(xiàn)象，造成經(jīng)濟(jì)效益不高[8]。造成這些現(xiàn)象的主要原因是菌種質(zhì)量差[9]。能否培育優(yōu)質(zhì)菌種的關(guān)鍵是適宜的培養(yǎng)基配方[10]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)多個(gè)菌種培養(yǎng)基配方,篩選出最適于靈芝培養(yǎng)的母種培養(yǎng)基、原種培養(yǎng)基、栽培種培養(yǎng)基配方，為了能夠更有效地進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用真菌資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種:7號(hào)五指山地區(qū)野生靈芝

1.1.2 藥品材料:馬鈴薯、瓊脂、葡萄糖、蔗糖、木屑、麥麩、棉籽殼、石膏、75%酒精、95%酒精。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方

母種培養(yǎng)基的配方:

（1）PDA：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、1 000 mL； （2）PSA：馬鈴薯 200.0 g、 蔗糖 20.0 g、瓊脂 20.0 g、 水 1 000 mL； （3）PDA+K++Mg2+：馬鈴薯200.0 g、 葡萄 糖 20.0 g、 瓊脂 20.0 g、KH2PO43 g、Mg SO41.5 g、1 000 mL； (4)PDA+木屑： 馬鈴薯200.0 g、 葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、100 g木屑取汁1 000 mL；

原種和栽培種培養(yǎng)基的配方:

（1） 木屑 990 g、 石膏 10 g和水 1 300 mL； （2） 木屑790 g、 麥麩200 g、 石膏 10 g和水 1 300 mL； （3） 棉籽殼790 g、 麥麩 200 g、 石膏 10 g和水 1 300 mL； （4）棉籽殼990 g、石膏10 g和水1 300 mL。

1.2.2 培養(yǎng)基的制作與培養(yǎng)

母鐘按常規(guī)方法制作平板培養(yǎng)基，121℃，滅菌20min，培養(yǎng)基滅菌之前pH調(diào)整為6.5，總共4個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

原種和栽培種按常規(guī)方法制，原種用瓶，栽培種用袋，121℃，滅菌2 h，培養(yǎng)基滅菌之前pH調(diào)整為6.5，總共4個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

培養(yǎng)的條件為：室溫 （25±2）℃，濕度為60%～65%，黑暗。

1.2.3 測(cè)量和觀察的指標(biāo)

母鐘第7天時(shí)測(cè)量菌絲的速度 （生長(zhǎng)速度/cm·d-1=菌絲長(zhǎng)度cm/d），觀察菌絲的粗度 （粗、中等、細(xì)）、生長(zhǎng)勢(shì)（強(qiáng)、中等、弱）、疏密程度 （較密、密、疏）、顏色。

原種和栽培種第12天時(shí)測(cè)量菌絲的速度，觀察菌絲的粗度 （較粗、粗、細(xì)、較細(xì)）、生長(zhǎng)勢(shì) （較強(qiáng)、強(qiáng)、弱、較弱）、疏密程度 （較密、密、疏、較疏）、顏色。并記錄長(zhǎng)滿瓶和袋的天數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王韶華教授發(fā)明的stst軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方對(duì)母種生長(zhǎng)的影響

圖1 不同培養(yǎng)基配方對(duì)母種菌絲生長(zhǎng)的影響

表1 不同培養(yǎng)基配方對(duì)母種生長(zhǎng)的影響

不同培養(yǎng)基配方對(duì)母種菌絲生長(zhǎng)的影響 （圖1和表1），結(jié)果顯示在4種培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)速度存在極顯著性差異，靈芝菌絲在PDA+木屑培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，其生長(zhǎng)速度為1.213 cm·d-1，菌絲較細(xì)、較密、純白、生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)；在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度次之，其生長(zhǎng)速度為1.15cm/d，菌絲細(xì)、密、純白、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)；在PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較慢，菌絲較粗、疏、純白、生長(zhǎng)勢(shì)弱；PDA+K++Mg2+培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)速度最慢，菌絲體較粗、較疏、純白、生長(zhǎng)勢(shì)最弱。

圖2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)原種生長(zhǎng)的影響 （第12d）

表2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)原種生長(zhǎng)的影響

因此，根據(jù)綜合指標(biāo)，PDA+木屑培養(yǎng)基為母種最佳培養(yǎng)基。

2.2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)原種生長(zhǎng)的影響

圖2和表2顯示，靈芝菌絲在棉籽殼培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度最快，其生長(zhǎng)速度為4.778 mm·d-1，菌絲最粗壯、濃密、純白，但是滿瓶后出現(xiàn)了發(fā)黃現(xiàn)象，滿瓶時(shí)間為16 d；在棉籽殼+麥麩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為4.052 mm·d-1，生長(zhǎng)速度次之，菌絲較粗壯、濃密、純白，滿瓶后無(wú)發(fā)黃現(xiàn)象，滿瓶時(shí)間為20 d；木屑+麥麩培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速度較慢，其生長(zhǎng)速度為3.657 mm·d-1，菌絲粗壯，稍稀疏，純白，滿瓶后無(wú)發(fā)黃現(xiàn)象，滿瓶時(shí)間為23 d；木屑培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速度最慢，剛開(kāi)始生長(zhǎng)情況不良，幾乎不長(zhǎng)，其生長(zhǎng)速度為2.453 mm·d-1，滿瓶時(shí)間為32 d。綜合各種指標(biāo)棉籽殼培養(yǎng)基更適合靈芝的培養(yǎng)，但是棉籽殼培養(yǎng)基后期容易發(fā)生黃化現(xiàn)象，在生產(chǎn)中要注意及使用。

圖3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)栽培種生長(zhǎng)的影響

3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)栽培種生長(zhǎng)的影響

靈芝在棉籽殼培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度最快，其生長(zhǎng)速度為4.366 mm·d-1，滿袋時(shí)間為40 d；棉籽殼+麥麩培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度次之，其生長(zhǎng)速度為3.796mm·d-1，滿袋時(shí)間為45 d；木屑+麥麩培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速度較慢，其生長(zhǎng)速度為3.269 mm·d-1，滿袋時(shí)間為51 d；木屑培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速度最慢，剛開(kāi)始生長(zhǎng)情況很不好，幾乎不長(zhǎng)，其生長(zhǎng)速度為2.135mm·d-1，滿袋時(shí)間為61 d。綜合各種指標(biāo)，栽培種最適培養(yǎng)基為棉籽殼，結(jié)果和原種培養(yǎng)基類似。

表3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)母種生長(zhǎng)的影響

4 討論與結(jié)論

菌種質(zhì)量的好壞直接影響到栽培能否成功和產(chǎn)量、質(zhì)量，菌種的質(zhì)量受多種因素的影響，但最關(guān)鍵因素為培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)狀況，因此，培養(yǎng)基的選擇具有重要意義。

母種質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)： （1）轉(zhuǎn)管次數(shù)：最多不超過(guò)4次~5次； （2）菌齡：低溫保存不超過(guò)6個(gè)月； （3）外觀：菌絲濃白、粗壯、富有彈性、爬瓶力強(qiáng)，沒(méi)有干燥、收縮現(xiàn)象和大量紅褐色液體； （4）長(zhǎng)勢(shì)：菌絲生長(zhǎng)快、整齊、濃而健壯； （5）溫度適應(yīng)性：在適溫培養(yǎng)后，放在高溫下培養(yǎng)幾小時(shí)，菌絲仍能健壯生長(zhǎng)的； （6）干濕性鑒定；（7）出菇試驗(yàn)。原種和栽培種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)： （1）菌絲生長(zhǎng)健壯，絨狀菌絲多，生長(zhǎng)整齊； （2）菌絲己長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，有的要求有分化的子實(shí)體原基。有菇香味，無(wú)異味；（3）菌絲色澤潔白或符合該菌的顏色； （4）菌種瓶?jī)?nèi)無(wú)雜色出現(xiàn)和無(wú)雜菌污染； （5）菌種瓶?jī)?nèi)無(wú)黃色汁液滲出；（6）菌種培養(yǎng)基不能干縮與瓶壁分開(kāi)。

在本試驗(yàn)中靈芝菌絲在PDA+木屑培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，可能是由于靈芝屬木腐型真菌，在PDA+木屑培養(yǎng)基中，木屑過(guò)濾液可提供木質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)；在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，必須提供充足且均衡的營(yíng)養(yǎng)，菌絲才能生長(zhǎng)良好，營(yíng)養(yǎng)缺乏后過(guò)剩都影響菌絲的生長(zhǎng)，在本試驗(yàn)中，純木屑培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)缺乏，菌絲生長(zhǎng)不良。但棉籽殼本身營(yíng)養(yǎng)豐富，已經(jīng)能滿足菌絲的生長(zhǎng)，在加入麥麩后由于營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，菌絲反而生長(zhǎng)不良。

總之，依據(jù)菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，綜合各種試驗(yàn)指標(biāo)，野生靈芝母種最佳培養(yǎng)基為PDA+木屑培養(yǎng)基，原種和栽培種最佳培養(yǎng)基均為棉籽殼，本試驗(yàn)為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的靈芝菌種提供可靠的參考依據(jù)。

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