KGF－1二硫鍵突變體對肝纖維化的保護作用

謝 敏，萬 穎，張增濤，何建軍，楊 黎，范 開

(1.重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054;2.重慶富進生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400041)

天然野生型 hKGF－1(keratinocyte growth factor－1，KGF－1)［1］由163 個氨基酸組成，含5 個 Cys，形成 Cys1－Cys15、Cys102－Cys106兩對二硫鍵，Cys40以游離形式存在于分子內(nèi)部。全長hKGF－1蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生聚集［2－4］。已有文獻報道［5］:將全長hKGF－1的N 端缺失23個氨基酸，只形成 Cys102－Cys106一對二硫鍵時(以下簡稱△23KGF－1)，不僅沒有影響其生物活性，還提高了穩(wěn)定性;另外，在△23KGF－1的基礎(chǔ)上針對其剩余的3個半胱氨酸依次進行定點突變發(fā)現(xiàn)，只有突變102位半胱氨酸對于其穩(wěn)定性沒有影響［6］。本研究在此基礎(chǔ)上將△23KGF－1第102位的Cys突變?yōu)?Ser［7］，這種新型的 hKGF－1 突變體(以下簡稱為△23Ser102KGF－1)［8］具有抗組織纖維化的功能，但是該研究并未證明其抗纖維化的功能與樣品是否與40位和106位的二硫鍵具有相關(guān)性。本研究以大鼠試驗性肝纖維化和肝星狀細胞為模型，進一步明確△23Ser102KGF－1突變體中的抗肝纖維化的功能與樣品中Cys102－Cys106這對二硫鍵的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品

△23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1凍干粉，重慶富進生物醫(yī)藥有限公司提供，純度99.0%，批號 20100603;羥脯氨酸試劑盒(堿)，南京建成生物工程研究所制造，批號110213;CCl4，重慶化學試劑廠生產(chǎn)，批號100405;人肝星狀細胞系，武漢細胞所提供;DMEM高糖培養(yǎng)基(1×)，賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司生產(chǎn)，批號 NWF6420;胎牛血清，Invitrogen公司生產(chǎn)，批號619559;乙腈，默克公司生產(chǎn)，色譜純;三氟乙酸，美國TEDIA生產(chǎn)。

1.2 主要儀器與實驗動物

清潔級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量220～250 g，由解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供;7600全自動生化分析系統(tǒng)，日本日立公司制造;SpectraMax190型酶標儀，美國 Molecular Devices公司制造;CO2細胞培養(yǎng)箱(型號HF151UV)，日本三洋公司制造;安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng);DAD檢測器;二元輸液泵;ultimate XB－C18色譜柱，規(guī)格:4.6 ×250 mm，5 μm，300?。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)構(gòu)確認

將△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1凍干粉通過還原和非還原肽圖分析其二硫鍵的形成情況。樣品處理及色譜條件參照《中華人民共和國藥典》2010年版第3部附錄ⅧE“肽圖檢查法”。

1.3.2 人肝星狀細胞系體外活性測定

將人肝星狀細胞系(hepatic stellate cell，HSC)快速解凍并培養(yǎng)于含有10%FBS和0.5%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)6 h，待細胞貼壁后更換新的含有10%FBS和0.5%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。用0.5%胰蛋白酶消化細胞傳代2次后用臺盼藍染色計數(shù)，并轉(zhuǎn)移至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔約5000個細胞，培養(yǎng)8 h。待細胞貼壁后，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基換成含有1.0%FBS和0.5%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基進行饑餓過夜培養(yǎng)。樣品的稀釋:① TGF－1陽性對照藥用含有1.0%FBS和0.5%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成 200、40、8、1.6、0.32IU 五個梯度，并設(shè)2個復(fù)孔。② △23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102KGF－1 C40－C106三種樣品均稀釋成0.32 ng、1.6 ng、8 ng、40 ng、200 ng、1 μg 六個梯度，并設(shè)2個復(fù)孔。饑餓培養(yǎng)結(jié)束后將上層培養(yǎng)基移除，并將上述稀釋好的陽性對照藥、3種樣品以及陰性對照組加入細胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后用MTS于37℃染色1 h，490 nm處測定OD值。

1.3.3 肝纖維化模型的建立和治療

SD大鼠于清潔條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分成5組:空白對照組、模型組、△23KGF－1組、△23Ser102KGF－1 組 和 △23Ser102C40－C106KGF－1組，每組6只。

模型的建立:模型組和給藥組用20%CCl4灌胃(CCl4與玉米油1∶4混合)，劑量2 mL/kg，每周2次，連續(xù)8周。

給藥:造模的同時，正常對照組和模型組腹部皮下注射適量生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周?！?3KGF－1、△23Ser102C40－C106KGF－1 和△23Ser102KGF－1造模同時腹部皮下注射藥物，劑量為3 mg/kg，每天1次，連續(xù)8周。所有大鼠在第56 d處死，股動脈收集血液進行血液生化指標的測定，并取新鮮的肝組織相對固定的位置進行甲醛固定、制片和羥脯氨酸的測定。

1.3.4 檢測指標

取大鼠的血清進行谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的測定。取新鮮的肝組織進行羥脯氨酸的測定。取大鼠肝臟用福爾馬林進行固定，Masson染色，制備成病理切片。

1.3.5 統(tǒng)計學處理

將大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和羥脯氨酸含量用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行t分布計算和標準差分析，結(jié)果用ˉx±s表示，P＜0.05表達差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)分析

由圖1可見在非還原肽圖中保留時間為21 min的峰經(jīng)還原肽圖處理后變成19 min和24 min的2 個峰，證明△23Ser102C40－C106KGF－1 組的樣品含有1對二硫鍵，且形成完全，因為樣品只含有40位和106位2個半胱氨酸，因此可以確定△23Ser102C40－C106KGF－1 組含有 C40－C106這一對二硫鍵。由圖2可見△23Ser102KGF－1組的還原肽圖和非還原肽圖可以完全重合，因此可以說明△23Ser102KGF－1組不含二硫鍵。

2.2 3種KGF－1突變體對hHSC體外測活結(jié)果

由圖3結(jié)果可見:與△23KGF－1和△23Ser102C40－C106KGF－1 兩組相比，△23Ser102KGF－1 組對人HSC細胞系有明顯的抑制作用，并且與劑量呈正相關(guān)性;△23KGF－1 和 △23Ser102C40－C106KGF－1 兩組抑制作用不明顯。由圖4可見，與空白組相比，TGF－1有明顯的刺激作用，這與文獻報道的一致［9］。

圖4 TGF和空白2個樣品對人肝星狀細胞系的作用

2.3 血液生化指標和羥脯氨酸檢測結(jié)果

由表1結(jié)果可見:與模型組比較，△23Ser102KGF－1組大鼠血清 AL T、AS T水平均明顯降低(P＜0.05)，同時對肝組織中Hyp量的升高也有一定抑制作用(P＜0.05);但未見△23KGF－1組和△23Ser102C40－C106KGF－1 組對 AL T、AS T 和 Hyp有明顯影響。

表 1 △23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1 三個樣品的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和羥脯氨酸結(jié)果

2.4 大鼠肝臟病理組織學檢驗結(jié)果

由病理切片(圖5)可見:連續(xù)造模4周后，模型組肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞嚴重，肝細胞索排列紊亂并且水腫，匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)可見肝細胞大面積死亡，炎細胞浸潤嚴重，大量脂肪細胞變性，膠原纖維明顯并形成了假小葉，大部分動物肝纖維化程度達到5級;△23Ser102KGF－1組與正常組相比可見部分肝脂肪細胞變性，以水樣變形為主，少量炎細胞浸潤局部細小纖維增生但未形成間隔，細胞索排列較整齊，肝纖維化程度多為1～2級;△23Ser102C40－C106KGF－1 組大量脂肪細胞變性，肝細胞索排列紊亂并且呈水樣變性，少量炎細胞浸潤局部細小纖維增生但未形成間隔，大部分動物肝纖維化程度達到2～3級;△23KGF－1組肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞嚴重，肝細胞索排列紊亂并且水腫，氣球樣變，匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)可見肝細胞大面積死亡，炎細胞浸潤嚴重，大量脂肪細胞變性，膠原纖維明顯并形成了假小葉，大部分動物肝纖維化程度達到5級或以上。

圖 5 △23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1組的大鼠肝臟病例切片(Masson染色40倍)

3 討論

肝纖維化的過程實際上是一個肝臟細胞受損的應(yīng)激過程。當肝細胞受到機械損傷或者病毒感染等不良刺激之后，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)被激活，并大量合成細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)［10］，從而加速了肝纖維化的進程。實際上，肝纖維化的過程是一系列細胞因子與其受體相互作用的結(jié)果，例如TGFβ－1及其受體TRⅠ、IL－1及其受體等，這些細胞因子與其受體結(jié)合并作用，從而刺激肝星狀細胞等的分裂，導致病情的加重，由此可見細胞因子是肝纖維化最重要的一環(huán)，因此如何抑制細胞因子的分泌和阻斷受體的結(jié)合就成為了肝纖維化治療的靶點。本研究組在體外細胞實驗中將3種突變的細胞因子直接作用于人肝星狀細胞系，發(fā)現(xiàn):KGF－1突變體蛋白不含Cys40－Cys102二硫鍵組，可明顯抑制人肝星狀細胞系的生長，因此可以推斷KGF－1突變體的抗纖維化作用可能跟抑制肝星狀細胞的生長并間接影響其生長因子的分泌有關(guān)。

文獻［11］報道蛋白質(zhì)二硫鍵的形成與否可以改變蛋白質(zhì)的三級或者四級結(jié)構(gòu)，從而影響其空間構(gòu)象和功能。本實驗用大鼠實驗性肝損傷和人肝星狀細胞系進一步證明了蛋白質(zhì)的二硫鍵會影響其生物學功能。本實驗不僅對于抗纖維化的機理和研發(fā)新型抗纖維化藥物具有比較重大的意義，而且本實驗探討的蛋白質(zhì)的功能與二硫鍵的關(guān)系還可以為以后深入研究蛋白質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系提供參考。

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