長效多肽藥物化學(xué)修飾的研究進展

姜 和，龔夢嘉

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.重慶前沿生物技術(shù)公司，重慶 400041)

多肽類藥物作為近年來研究的熱點，受到國內(nèi)外制藥界的廣泛關(guān)注，在癌癥、艾滋?。?］等重大疾病的治療中顯示出巨大的應(yīng)用價值。

多肽類藥物雖然安全、生物活性好，但多數(shù)因半衰期較短而需頻繁給藥，這使病人的依從性大大降低，并且治療費用也較大，因此，為了保持藥效的持久、不用頻繁給藥，對于長效多肽類藥物的研發(fā)近年來成為了多肽藥物領(lǐng)域的研究熱點。多肽類藥物的長效化技術(shù)主要有體外化學(xué)修飾技術(shù)、生物技術(shù)和緩控釋制劑技術(shù)［2］。體外化學(xué)修飾技術(shù)是在多肽水平上，使用合適的修飾方法和修飾劑對其進行化學(xué)修飾［3］，使修飾后的多肽類藥物在體內(nèi)的半衰期延長。該技術(shù)主要包括主鏈末端的修飾［4］、側(cè)鏈的修飾［5］、環(huán)化［6］、氨基酸替換［7］、糖基化修飾［8］及 PEG 修飾［9］等。

1 主鏈末端的修飾

多肽類藥物常用的主鏈末端修飾方法是N端的乙?；饔煤虲端的酰胺化作用［10］，分別對肽鏈兩端氨基和羧基進行保護，使多肽不會很快地被相應(yīng)的多肽蛋白酶降解。目前這一技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多肽的化學(xué)合成中。N端乙?；ǔＪ窃诠滔嗪铣啥嚯姆磻?yīng)的整個肽鏈組合完畢后，加入乙酸酐使其乙?；?。C端的酰胺化則是通過選擇裂解產(chǎn)物為酰胺的樹脂或者選擇不同裂解方式來完成。Brinckerhoff等［11］通過對具有免疫原性的多肽MART-I27-35進行N端的乙?；蛘逤端的酰胺化，明顯提高了該多肽在血漿中的穩(wěn)定性。

主鏈末端連接不同長度的脂肪酸、主鏈C端或N端的PEG修飾及糖基化修飾，其基本原理都是增加多肽分子的相對分子量和空間位阻，提高其對多肽水解酶的穩(wěn)定性，減少腎小球的濾過作用。RC-160是一種具有抗增生活性的生長激素抑制劑類似物。Dasgupta等［12］將各種長度的脂肪酸連接在RC-160的主鏈末端。與未修飾的RC-160相比較，修飾后的RC-160對于胰島素有更高的抵抗能力和更長的半衰期。

2 側(cè)鏈的修飾

多肽側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾是通過選擇性試劑(也稱修飾劑)與多肽側(cè)鏈上特定的功能基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而實現(xiàn)，從而改變多肽的化學(xué)性質(zhì)，如消除免疫原性和免疫反應(yīng)性、延長了多肽藥物在體內(nèi)的作用時間等［13－14］。David Sabatino 等［15］在對生長激素釋放多肽(growth hormone releasing peptide，GHRP-6)類似物的合成研究中，通過對Trp2、Ala3、Trp4的化學(xué)修飾，在側(cè)鏈上連接不同的基團(如圖1所示)，從而形成氮雜多肽(aza-peptide)。在考察經(jīng)修飾的各種氮雜多肽的IC50時，發(fā)現(xiàn)其中一種結(jié)構(gòu)為His-D-Trp-Ala-azaPhe-D-Phe-Lys-NH2的氮雜多肽與受體的結(jié)合率是未經(jīng)修飾的GHRP-6的1000倍。

圖1 GHRP-6及其類似物結(jié)構(gòu)式

正交保護氨基酸在固相多肽合成中的應(yīng)用對多肽的側(cè)鏈修飾起著重要的作用。正交保護是指在一定條件下，分子中的一組保護基可以被選擇性地脫除，而其他保護基不受影響，進而達到可選擇性修飾的目的［16］。謝東等［17］在合成的長效HIV融合抑制劑艾博衛(wèi)泰中，對第13位的賴氨酸(Lys)采用 Alloc保護的Fmoc-Lys(Alloc)-OH，用特定的條件選擇性地脫除保護基Alloc，而另一氨基保護基Fmoc和肽鏈上其他氨基酸的側(cè)鏈保護基均不受影響，再用Fmoc-AEEA(Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸)和MIPA(3-馬來酰亞胺基丙酸)對Lys13進行修飾，使肽鏈進入血液后能夠迅速與白蛋白結(jié)合，從而發(fā)揮長效的作用。經(jīng)臨床實驗驗證，艾博衛(wèi)泰的半衰期可長達2周。

對肽鏈中某一個氨基酸進行定點修飾是側(cè)鏈修飾的一項前沿的、重要的技術(shù)，也是實現(xiàn)側(cè)鏈修飾可控的保證。Peng Wu等［18］報道了重組蛋白在哺乳動物細胞中表達，通過基因編碼乙醛標記可對重組蛋白中的某些特定位點進行特異性的乙醛標記，這些乙醛標記既可作為定點修飾的位點，也可用于進一步的化學(xué)修飾。這項技術(shù)已應(yīng)用在對單克隆抗體、多肽類藥物等的定點修飾中。

3 環(huán)化

在多數(shù)情況下，機體內(nèi)的氨肽酶及羧肽酶很容易從常見的直鏈肽的兩端進行逐步的切割分解，使直鏈肽被降解，因此，對肽鏈進行環(huán)化結(jié)構(gòu)改造，可以提高多肽類藥物在機體內(nèi)的生物穩(wěn)定性，延長半衰期［19］。按照橋頭環(huán)化位置可將環(huán)肽分為5類:C端與N端相連、側(cè)鏈間相連、N端與側(cè)鏈相連、C端與側(cè)鏈相連以及主鏈上的N-N相連［20］，如圖2 所示。

圖2 按照橋頭環(huán)化位置的環(huán)肽分類

生長調(diào)節(jié)因子(growth regulating factor，GRF)是由29個氨基酸組成的多肽，肽序為YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLL QDIMSR。該多肽在37℃的豬血漿中的半衰期只有15 min。研究人員選取不同位點進行環(huán)化處理，得到不同的衍生物，實驗結(jié)果如表1所示，其半衰期明顯提高到4 h以上［21］。

表1 環(huán)化修飾后GRF類似物在豬血漿中的穩(wěn)定性

Annett Rozek等［22］報道了一吲哚類多肽類似物 CP-11，結(jié)構(gòu)為 ILKKWPWWPWR RK-NH2，通過二硫鍵進行成環(huán)修飾，得到cycloCP-11，在胰島素共同存在和作用下，可以使胰島素的半衰期由4 min提高到 18 min。LEDGF(lens epithelium-derived growth factor)/p75是 HIV-1整合酶。Zvi等［23］通過對LEDGF/p75結(jié)構(gòu)和功能的研究，取該蛋白質(zhì)中的一段肽鏈，合成HIV-1整合酶抑制劑LEDPG 361-370，合成過程中應(yīng)用Alloc保護的氨基酸，并進行特異性保護基的脫除，實現(xiàn)直鏈肽的首尾成環(huán)(圖3)。LEDPG 361-370半衰期可長達8 d。

圖3 LEDPG 361-370結(jié)構(gòu)

4 氨基酸替換

替換肽鏈中的某幾個氨基酸是另一種推遲酶降解使多肽藥物的半衰期延長的方式，替換對象通常為肽鏈中的易酶解的氨基酸。

將L型氨基酸替換為D型非天然氨基酸是氨基酸替換的一種常規(guī)方法。西曲瑞克(cetrorelix)是一種促黃體激素釋放激素(luteinizing hormone releasing hormone，LHRH)拮抗劑，用于治療子宮纖維瘤、子宮內(nèi)膜異位、卵巢癌以及改善良性前列腺肥大。西曲瑞克是將LHRH中的幾個氨基酸替換為非天然的D型氨基酸，結(jié)構(gòu)對比如圖4所示［24］。西曲瑞克在多種酶存在的情況下半衰期可長達50 h，而LHRH的半衰期只有幾小時［25］。從西曲瑞克的用法和劑量也可以看出其長效性:單劑量給藥0.25 mg，作用可持續(xù)24 h;一次注射3 mg，藥效可維持4 d。

圖4 LHRH與西曲瑞克結(jié)構(gòu)比較

Strausberg等［26］對枯草桿菌蛋白酶中隨機的一段12個氨基酸組成的多肽鏈進行氨基酸替換，以對溫度的穩(wěn)定性和催化活性為基礎(chǔ)進行篩選。篩選結(jié)果表明，在高溫環(huán)境下，修飾后的產(chǎn)物半衰期最大可高達原枯草桿菌蛋白酶的15000倍。粒細胞多肽(human neutrophil peptides，HNP)是一種具有抗微生物活性和細胞毒性的多肽，其對胃癌細胞具有一定的毒性作用［27］。Linda 等［28］將人類嗜中性粒細胞肽(human neutrophil peptides，HNPs)序列中的精氨酸(Arginine)替換為鳥氨酸(Ornithine)，通過藥物代謝動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)168 h后仍有26%的經(jīng)修飾后的HNP-Ornithine存在。

5 糖基化修飾

糖肽是指寡糖結(jié)構(gòu)與多肽鏈中某些特殊氨基酸側(cè)鏈上的功能團以共價鍵的形式相連接的一類多肽類物質(zhì)［29］。糖基化修飾是指多肽附加上糖類的這一過程。在多肽的固相合成中，最常用的為N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化通過天冬酰胺使側(cè)鏈的酰胺氮進行連接。O-糖基化是指多肽與絲氨酸或蘇氨酸殘基上的氧相連接［30-31］。

多肽藥物的糖基化修飾增加了側(cè)鏈的空間位阻，提高了多肽對酶的穩(wěn)定性。如alglucosidase alfa(myozyme，shire)用于治療龐培氏病，按20 mg/kg(體質(zhì)量)劑量，每2周注射1次［32］。darbepoetin alfa(aranesp，amgen)是促紅細胞生長素(erythropoietin，EPO)糖基化修飾后的產(chǎn)品，用于治療慢性腎功能衰竭及貧血，使用頻率從老一代EPO的每周2～3次降低至每周1次或每2周1次［33］。TY027是一種阿片受體拮抗劑，在大鼠血漿中的半衰期只有4.8 h。為了得到更加穩(wěn)定的止痛劑，Takashi等［34］以TY027為原型進行糖基化修飾，引入一個 O-β-(Ser(Glc))，以 Fmoc-Ser(O-β-D-Glc(OAc)4)-OH為原料，通過Fmoc固相合成多肽法得到TY027糖基化的修飾產(chǎn)物，TY027及該修飾后產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如圖5所示。通過代謝穩(wěn)定性實驗，在大鼠血漿中孵化24 h仍然有70%完整的該修飾產(chǎn)物能被檢測到。G.E.Umpierrez等［35］報道了LY2189265是一種新型的長效胰高血糖素(GLP-1)受體拮抗劑，用于治療Ⅱ型糖尿病。通過糖基化修飾，該藥物只需每周注射1次，大大提高了病人的依從性。

圖5 TY027及糖基化后產(chǎn)物結(jié)構(gòu)比較

6 PEG修飾

聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)是由環(huán)氧乙烷聚合而成的大分子聚合物，結(jié)構(gòu)式為HO-C(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。PEG類修飾劑具有無毒、良好的溶解性和生物相容性、寬泛的相對分子量選擇范圍等優(yōu)點。經(jīng)PEG修飾后的多肽類藥物相對分子量有所增加，可降低腎小球的濾過效率，增強藥物對酶的穩(wěn)定性，從而延長藥物在體內(nèi)的半衰期［36］。

目前應(yīng)用最普遍的PEG修飾劑是單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，結(jié)構(gòu)為 CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH［37］。PEG修飾多肽類藥物時，為了使PEG能在較溫和的反應(yīng)條件下與多肽偶聯(lián)，故需先將PEG活化，再將活化后的PEG與多肽肽鏈的C端、N端以及側(cè)鏈上的氨基、巰基和羧基進行偶聯(lián)［38］。

1990年，美國食品與藥品管理局(FDA)批準了第1個PEG修飾蛋白質(zhì)類藥物pegademase(adagen，enzon)上市。pegademase是由聚乙二醇修飾的腺苷脫氨酶，用于治療嚴重的合并性免疫缺陷病癥，給藥頻率為每周1次，從給藥頻率上體現(xiàn)了修飾后藥物的長效性，減少了病人因頻繁給藥而帶來的痛苦［39］。到目前為止，已有多種經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)多肽類藥物獲FDA批準上市銷售，包括PEG修飾的天冬酰胺酶、重組人粒細胞集落刺激因子、干擾素等(表2)［40］。這些藥物在臨床應(yīng)用中也體現(xiàn)出了PEG修飾的優(yōu)勢。從給藥頻率不難看出PEG修飾在延長蛋白質(zhì)多肽類藥物的半衰期上有顯著作用。目前還有大批的研究者致力于PEG修飾多肽類藥物的研究，也有很多新的PEG修飾藥物處于研發(fā)甚至臨床階段［41－43］。但PEG修飾劑本身的分散性造成了修飾后的藥物具有一定分散性，這會直接影響到產(chǎn)品的生物相容性、化學(xué)性能以及臨床功效等，這也是目前困擾PEG修飾的一大難點。解決途徑:①注重PEG的合成和純化，以保證PEG修飾劑本身的質(zhì)量;②特異性定點修飾技術(shù)的應(yīng)用以及對最佳反應(yīng)條件的探索。

表2 FDA批準上市的PEG修飾蛋白多肽類藥物

7 結(jié)束語

據(jù)2010年調(diào)查，目前全世界市場銷售的多肽類藥物主要有51個品種，其中有6個品種在2008年銷售額超過了7.5億美元，總銷售額高達88.3億美元。但由于多肽在體內(nèi)具有不穩(wěn)定性、易被水解、易被腎臟清除等特性，使得多肽類藥物半衰期短，從而必須頻繁給藥，因此對多肽藥物的長效化研究顯得尤為迫切?；瘜W(xué)修飾是多肽類藥物長效化技術(shù)中的常用方式，是藥物設(shè)計的重要手段。在目前的臨床應(yīng)用中，通過化學(xué)修飾得到的長效多肽類藥物已顯現(xiàn)出其優(yōu)良的性能。

在今后的研究中:一是對于藥物靶向性的研究，通過特異性的化學(xué)修飾實現(xiàn)藥物和病灶位點的特異性結(jié)合，使藥物在發(fā)揮更好藥效的同時，盡量降低對其他健康組織器官的傷害;二是將化學(xué)與生物方法相結(jié)合應(yīng)用于多肽藥物長效化技術(shù)的探索，集兩者的優(yōu)勢，共同開發(fā)新型的復(fù)合型長效化技術(shù);三是尋找便于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的化學(xué)修飾方法，使藥物從實驗室研究走向工業(yè)化生產(chǎn)及上市銷售，最終真正造福病人。

［1］Brian L B.Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis［J］.Nature Review，2003，2:587-593.

［2］黃寶斌，袁力勇，王軍志.長效蛋白和多肽類藥物的研發(fā)現(xiàn)狀［J］.國際生物制品學(xué)雜質(zhì)，2008，31(1):31-34.

［3］Werle M，Bernkop-Schnurch A.Strategies to improve plasma half life time of peptide and protein drugs［J］.AminoAcids，2006，30:351-367.

［4］Sabrina Trussel，Christoph Dumelin，Katharina Frey，et al.New Strategy for the Extension of the serum Half-life of Antibody Fragments［J］.Bioconjugate Chem，2009，20:2286-2292.

［5］Qingyu Sun，Hosea Nelson，Tony Ly，et al.Side Chain Chemistry Mediates Backbone Fragmentation in Hydrogen Deficient Peptide Radicals［J］.Journal of Proteome Research，2009，8:958-996.

［6］Sheng Jiang，Zheng Li，Ke Ding，et al.Recent Progress of Synthetic Studies to Peptide and Peptidomimetic Cyclization［J］.CurrentOrganic Chemistry，2008，12:1502-1542.

［7］Samuel Blanquart，Nicolas Lartillot.A Site-and Time-Heterogeneous Model of Amino Acid Replacement［J］.Mol Biol Evol，2008，25(5):842-858.

［8］Ricaedo J S，Kai G.Effects of Glycosylation on the Stability of Protein Pharmaceuticals［J］.Journal of Pharmaceutical Sciences，2009，98(4):1223-1245.

［9］Roberts M J，Bentley M D，Harris J M.Chemistry for peptide and protein PEGylation［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54:459-476.

［10］Oyston P C F，F(xiàn)ox M A，Richardsand S J，et al.Novel peptide therapeutics for treatment of infections［J］.Journal of Medical Microbiology，2009，58，977-987.

［11］Brinckerhoff L H，Kalashnikov V，Thompson L W，et al.Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-I(27-35)peptide:implications for peptide vaccines［J］.Int J Cancer，1999，83:326-334.

［12］Dasgupta P，Singh A，Mukherjee R.N-terminal acylation of somatostatin analog with long chain fatty acids enhances its stability and anti-proliferative activity in human breast adenocarcinoma cells［J］.Biol Pharm Bull，2002，25:29-36.

［13］付慧君，周寧，周英等.抗蛋白酶降解肽類藥物的結(jié)構(gòu)修飾研究進展［J］.國外醫(yī)藥:醫(yī)學(xué)分冊，2006，33(4):269-271.

［14］Sabrina Trussel，Christoph Dumelin，Katharina Frey，et al.New Strategy for the Extension of the Serum Half-Life of Antibody Fragments［J］.Bioconjugate Chem，2009(20):2286-2292.

［15］David Sabatino，Caroline Proulx，Sophie Klocek，et al.Exploring Side-Chain Diversity by Submonomer Solid-Phase Aza-Peptide Synthesi s［J］.Organic Letters，2009，11(16):3650-3653.

［16］Norbert Sewald，Hans-Diter Jakubke.Peptide:Chemisty and biology［M］.Germany:Wiley-VCH Verlag Publ，2002:135-256.

［17］Dong Xie，He Jiang.An Albumin-Conjugated Peptide Exhibits Potent Anti-Human Immunodeficiency Virus Activity and Long In Vivo Half-Life［J］.ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY，2010，54(1):1-6.

［18］Peng Wu，Wenqing Shui，Brian L.Carlson，et al.Site-specific chemical modification of recombinant Proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag［J］.PANS，2009，106(9):3000-3005.

［19］王德心，韓香，龔喜等.環(huán)肽的合成研究進展［J］.有機化學(xué)，2008，28(4):549-573.

［20］Soledad R G，Norbert Sewald.Synthesis of chemically modified bioactive peptide:recent advances，challenges and developments for medicinal chemistry［J］.Future Med Chem，2009，1(7):1289-1310.

［21］Su C M，J ensen L R，Heimer E P，et al.In vitro stability of growth hormone releasing factor(GRF)analogs in porcine plasma［J］.Horm Metab Res，1991，23:15-21.

［22］Rozek A，Powers JP，F(xiàn)riedrichCL，et al.Structure-based design of anindolicidin peptide analogue with increased protease stability［J］.Biochemistry，2003，42:14130-14138.

［23］Zvi Hayouka，Mattan Hurevich，Aviad Levin，et al.Cyclic peptide inhibitors of HIV-1 integrase derived from the LEDGF/p75 protein［J］.Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry，2010，18:8388-8395.

［24］蔡佳利，陳朝暉，耿蓉霞，等.抗癌藥西曲瑞克應(yīng)用研究新進展［J］.中國實用醫(yī)藥，2008，3(3):1-3.

［25］Reissmann T，Engel J.The LHRH antagonist cetrorelix［J］.Drugs Future，1994，19:228-237.

［26］Strausberg S L，Ruan B，F(xiàn)isher K E，et al.Directed coevolution of stability and catalytic activity in calcium-free subtilisin［J］.Biochemistry，2005，44:3272-3279.

［27］劉文超，張學(xué)庸，胡家露.人中性粒細胞多肽體外殺傷腫瘤細胞的實驗研究［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1999，20(9):408-411.

［28］Linda A S，Rodney L L，Bernadette R，et al.ADP-ribosylation of human defensin HNP-1 results in the replacement of the modified arginine with the noncoded amino acid ornithine［J］.PNAS，2009，106(47):19796-19800.

［29］張法，劉剛.糖肽的固相合成［J］.化學(xué)進展，2006，18(5):579-600.

［30］Wei X，Li L.Comparative glycoproteomics:approaches and application［J］.Brief Funct Genomic Roteomic，2008，8(2):104-113.

［31］Ricardo J S，Griebenow K.Glycosylation of Therapeutic Proteins:An Effective Strategy to Optimize Efficacy［J］.Bio Drugs，2010，24(1):9-21.

［32］Clark S E，Muslin E H，Henson C A.Effect of adding and removing N-glycosylation recognition sites on the thermostability of barley alpha-glucosidase［J］.Protein Eng Des Sel，2004，17(3):245-249.

［33］Marc A P，Emmanuel A B，Chao-Yin Chen，et al.Baseline Characteristics in the Trial to Reduce Cardiovascular Events With Aranesp Therapy(TREAT)［J］.A-merican Journal of Kidney Diseases，2009，54(1):59-69.

［34］Takashi Yamamoto，Padma Nair，NeilE Jacobsen，et al.Improving Metabolic Stability by Glycosylation:Bifunctional Peptide Derivatives That Are Opioid Receptor Agonists and Neurokin in 1 Receptor Antagonists［J］.J Med Chem，2009，52:5164-5175.

［35］Umpierrez G E，Blevins T，Rosenstock J，et al.The effects of LY2189265，a long-acting glucagon-like peptide-1 analogue，in a randomized，placebo-controlled，double-blind study of overweight/obese patients with Type 2 diabetes:the EGO study［J］.Diabetes，Obesity and Metabolism，2011，13:418-425.

［36］邊蕾，石屹峰.蛋白質(zhì)藥物長效化技術(shù)的現(xiàn)狀和進展［J］.中國生物工程雜志，2009，29(1):114-118.

［37］Roberts M J，Bentley M D，Harris J M.Chemistry for peptide and protein PEGylation［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54:459-476.

［38］路娟，羅國安，王義明，等.藥物的聚乙二醇修飾研究進展［J］.有機化學(xué)，2009，29(8):1167-1174.

［39］Hershfeld M S.Adenosine deaminase deficiency:clinical expression，molecular basis，and therapy［J］.Semin Hematol，1998，35:291-298.

［40］Jung Seok Kang，Patrick P DeLuca，Kang Choon Lee.E-merging PEGylated drugs［J］.Expert Opin，2009，14(2):363-380.

［41］Youn Y S，Chae S Y，Lee S，et al.Evaluation of therapeutic potentials of site-specific PEGylated glucagons-like peptide-1 isomers as a type 2 anti-diabetic treatment:insulinotropic activity，glucose-stabilizing capability，and proteolytic stability［J］.Biochem Pharmacol，2007，73:84-93.

［42］Youn Y S，Lee K C.Site-speciic PEGylation for highyield preparation of Lys21-amine PEGylated growth hormone-releasing factor(GRF)(1-29)using a GFR(1-29)derivative FMOC-protected at Tyr1 and Lys12［J］.Bioconjug Chem，2007，18:500-506.

［43］Youn Y S，Na D H，Lee K C.High-yield production of biologically active mono-PEGylated salmon calcitonin by site-speciic PEGylation［J］.J Control Rel，2007，117:371-379.