蚧蟲初孵若蟲采集、保存和玻片標(biāo)本制作1)

趙杰軍 王自力 陳曉鳴

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，昆明，650224)

蚧蟲屬半翅目(Hemiptera)蚧總科(Coccoidea)昆蟲的通稱，全世界報(bào)道蚧蟲有7364種［1］，中國記錄有1155種［2］。蚧蟲的分類鑒定主要依據(jù)雌成蟲的形態(tài)特征，較少涉及初孵幼蟲的形態(tài)特征。初孵幼蟲形態(tài)特征種間存在差異，對(duì)于種的鑒定具有重要的分類參考價(jià)值［3］。此外，蚧蟲寄主植物選擇機(jī)理研究應(yīng)首先弄清楚初孵幼蟲觸角、足和口器等感受器官的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，因?yàn)槌上x期這些感受器官發(fā)生退化，不能真實(shí)地反映蚧蟲選擇寄主過程中涉及的感受器官的形態(tài)特征［4］。蚧蟲初孵幼蟲為微小昆蟲，體長不足1 mm，用解剖鏡僅能觀察清楚蟲體輪廓如體形、體色、蠟絲等外部形態(tài)特征，采用掃描電鏡觀察，首先必須制作玻片觀察清楚蟲體的形態(tài)特征，再用掃描電鏡進(jìn)行重點(diǎn)形態(tài)結(jié)構(gòu)分析。蚧蟲初孵幼蟲柔軟、體被蠟絲，借用成蟲制作方法容易引起蟲體變形，借用其它微小昆蟲(蚜蟲)的制作方法不能完全除蠟，因此，探討蚧蟲初孵幼蟲玻片制作技術(shù)依然具有重要的價(jià)值。筆者以白蠟蟲初孵幼蟲玻片標(biāo)本制作為例，旨在提供蚧蟲初孵幼蟲的保存和玻片標(biāo)本的制作方法，主要介紹新引入的蟲體轉(zhuǎn)移用具與使用方法，以供相關(guān)的研究人員參考與交流。

1 標(biāo)本采集與保存

蚧蟲成蟲通常采用70%酒精保存，酒精容易引起蟲體表皮皺縮，玻片標(biāo)本主要適用表皮結(jié)構(gòu)觀察研究，而皺縮的表皮又會(huì)影響整體觀察效果。白蠟蟲初孵幼蟲的保存引入植物材料常用的保存液FAA。由于初孵幼蟲蟲體柔軟，F(xiàn)AA的配方為50%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福爾馬林5 mL，并按固定液體積的5%加入甘油。FAA與酒精保存液差別在于加入冰醋酸提高了滲透速度，使蟲體快速固定不變形，甘油軟化硬化結(jié)構(gòu)確保蟲體不變形，并且FAA可以同時(shí)保存蚧蟲及其寄主植物。一般采用FAA固定標(biāo)本0.5～2.0 h，即可進(jìn)入玻片制片階段。

在野外用剪刀取有蟲枝條或者葉片，若種蟲周圍有孵化的幼蟲，直接用毛筆掃蟲放入采集瓶;若種蟲周圍無孵化的幼蟲，則取有蟲寄主植物材料帶回室內(nèi)，放入培養(yǎng)皿(底墊光滑白紙)培養(yǎng)，待幼蟲孵化，用毛筆掃入標(biāo)本瓶。標(biāo)本采集完畢，在標(biāo)本瓶中加入蟲體體積20～30倍的保存液。蟲體固定一段時(shí)間后，更換保存液1～2次，室溫保存可達(dá)數(shù)年。

2 玻片標(biāo)本的制作

2.1 蟲體轉(zhuǎn)移工具

顯微眼科鑷子:由于蟲體微小，用一般的鑷子夾取極為困難，若采用顯微眼科鑷子(頭寬0.1 cm)可以輕松將蟲子移動(dòng)。用吸管取蟲雖操作方便，操作者不用訓(xùn)練就可以移動(dòng)蟲體，但吸管吸取蟲體的同時(shí)常夾帶其它雜質(zhì)，用顯微眼科鑷子夾取蟲體避免了吸管取蟲的缺點(diǎn)。

轉(zhuǎn)移蟲袋:在制片過程中，操作者通常發(fā)現(xiàn)蟲體經(jīng)過KOH處理后，蟲體幾乎透明，用肉眼極難辨認(rèn)，常規(guī)方法在蟲體清洗、染色和脫水等過程中容易將蟲體丟失，并且耗時(shí)，處理的標(biāo)本數(shù)量較少。若采用轉(zhuǎn)移蟲袋，可避免常規(guī)制片出現(xiàn)的問題，既節(jié)省時(shí)間，還適用于批量制作，更重要的是避免了每個(gè)制片環(huán)節(jié)挪動(dòng)蟲體，較為完整地保存了蟲體的細(xì)微結(jié)構(gòu)特征。此外，轉(zhuǎn)移蟲袋減少制片過程中接觸KOH、酒精、冰醋酸和二甲苯等溶液，使制片過程更為安全。轉(zhuǎn)移蟲袋采用200目以上的尼龍紗布制作，200目紗布孔徑不超過74 μm。制作方法簡單，將紗布裁剪為8 cm×4 cm方塊，按圖1所示虛線折疊，用昆蟲針或曲別針扣邊即可制作成轉(zhuǎn)移蟲袋(圖2)。

圖1 轉(zhuǎn)移蟲袋制作示意圖

圖2 轉(zhuǎn)移蟲袋

2.2 冰醋酸酒精混合脫水

在脫水過程中，采用常規(guī)的系列酒精溶液脫水，蟲體出現(xiàn)硬化、破碎，不易獲得完整的標(biāo)本。若采用酒精和冰醋酸體積比1︰1的混合溶液進(jìn)行脫水，蟲體細(xì)微結(jié)構(gòu)特征保存完好，并有利于整姿。酒精和冰醋酸的混合溶液設(shè)置70%、85%、95%、100%4個(gè)梯度，每個(gè)梯度用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的酒精和冰醋酸混合配制而成。

2.3 Euparal封片

微小昆蟲用中性樹脂或加拿大樹膠封片不容易整姿。用Euparal膠封片，可支持顯微鏡下緩慢地整理蟲體附肢。此外，Euparal膠封存的標(biāo)本更為平整和透明。

2.4 制作過程

①蟲體軟化與沖洗。用吸管吸取蟲子，放入轉(zhuǎn)移蟲袋，掛上標(biāo)簽，將轉(zhuǎn)移蟲袋浸泡在10%KOH溶液中，30～40℃水浴;當(dāng)蟲體發(fā)白，立刻投入蒸餾水(60℃)沖洗3～5次，每次5 min。②系列冰醋酸酒精混合液脫水。將轉(zhuǎn)移蟲袋放入系列冰醋酸酒精混合溶液中脫水，每處理3～5 min;蒸餾水沖洗。③1%酸性品紅染色。將沖洗完畢的轉(zhuǎn)移蟲袋，放入1%酸性品紅染液中，染色時(shí)間控制在30～90 min;待肉眼觀察到蟲體發(fā)紅即可。④100%冰醋酸酒精混合液清洗脫水。將染色的轉(zhuǎn)移蟲袋直接放入冰醋酸酒精體積比1∶1混合溶液洗脫1～2 min，重復(fù)2次。⑤丁香油透明。打開轉(zhuǎn)移蟲袋，用吸管吸取丁香油緩慢沖洗袋子將蟲子洗脫于小培養(yǎng)皿或稱量皿，透明處理2～3 h后，開始封片。⑥整姿封片。取載玻片，在玻片中央部位滴1滴Euparal膠。在解剖鏡下，用顯微眼科鑷子夾取完整透明的蟲體放在載玻片上，轉(zhuǎn)移到100倍顯微鏡下，用超微針整理蟲體足和觸角，用一根超微針輕輕壓住蟲體，另一根針撥動(dòng)附肢即可進(jìn)行整姿。取蓋玻片對(duì)準(zhǔn)蟲體接觸Euparal膠后，立刻松開手指，使蓋玻片自然沉降到蟲體身上，注意不可擠壓蓋玻片，以免壓碎蟲體。按照該方法制作的白蠟蟲初孵若蟲玻片標(biāo)本見圖3。

圖3 白蠟蟲初孵若蟲玻片標(biāo)本

3 結(jié)論與討論

白蠟蟲初孵幼蟲玻片制作與其它微小昆蟲制片方法基本一致，僅在保存液、脫水溶液、封片劑以及轉(zhuǎn)移工具和軟化處理?xiàng)l件等方面進(jìn)行了改進(jìn)，因此，白蠟蟲初孵幼蟲玻片標(biāo)本的制作方法同樣適用于其它一些微小昆蟲的玻片制作。

蟲體軟化是制作優(yōu)質(zhì)玻片的首要環(huán)節(jié)。用KOH軟化蟲子除內(nèi)臟時(shí)，水浴溫度不宜過高，控制在30℃為宜。當(dāng)蟲體發(fā)白時(shí)，立刻移入蒸餾水(60℃)清洗2～3次。對(duì)于體長小于0.5 mm的小型昆蟲，用超微針穿刺蟲體除內(nèi)臟，即使在100倍解剖鏡也很難準(zhǔn)確定位穿刺部位。因此，微小昆蟲除內(nèi)臟建議用KOH稀溶液水浴溶解法。脫水是制片過程中重要的中間環(huán)節(jié)。采用冰醋酸或酒精單一脫水溶劑處理獲得標(biāo)本不完整。若將冰醋酸酒精對(duì)半混合脫水處理的標(biāo)本較為完整。蟲體整姿、封片是微小昆蟲制片操作最為困難的環(huán)節(jié)。微小昆蟲必須在高倍顯微鏡下進(jìn)行整姿。整姿完畢后，用Euparal膠封片較少出現(xiàn)蟲體皺縮和氣泡。

在制片過程中，用轉(zhuǎn)移工具轉(zhuǎn)移蟲體使得蟲體的移動(dòng)變得更為簡便、快捷。通常采用挑蟲環(huán)、挖耳和吸管等工具轉(zhuǎn)移蟲體［5－9］。挑蟲環(huán)可能適用于相對(duì)較大的蟲體，并且需要練習(xí)，否則在溶液中挑蟲是困難的。吸管容易移動(dòng)蟲體，但同時(shí)夾帶雜質(zhì)。此外，微小昆蟲通常將少量的蟲體放在玻片上進(jìn)行脫水、染色和透明，操作者眼睛必須隨時(shí)盯住蟲體，否則蟲體在換溶液時(shí)易丟失。蟲體軟化后蟲體外骨骼透明，操作者憑肉眼幾乎無法辨認(rèn)蟲體位置。微小昆蟲制片使用轉(zhuǎn)移蟲袋可以解決常規(guī)制片存在的問題。

玻片標(biāo)本制作的安全性，逐漸受到了關(guān)注［6］。二甲苯透明標(biāo)本具有速度快、透明性好的特點(diǎn)，其副作用也明顯，建議使用丁香油代替二甲苯。昆蟲表皮屬于幾丁質(zhì)，以酸性品紅對(duì)幾丁質(zhì)的染色效果突出，所以在昆蟲玻片制作上應(yīng)廣泛使用酸性品紅。對(duì)于酸性品紅致癌性較少有人關(guān)注，酸性品紅滲透速度快，在染色過程中必須戴手套。

總之，微小昆蟲擬采用的制片方法必須確保獲得的玻片標(biāo)本清晰、潔凈和完整，操作簡單易行，對(duì)人體安全無毒副作用。

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