扇貝糖原酶法提取及其硫酸化修飾條件

曹 倩 倩，朱 蓓 薇，楊 靜 峰，宋 葉 涵，張 元 峰

（1.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品教育部工程研究中心，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)貝類專業(yè)分中心，遼寧 大連 116034）

0 引言

硫酸酯多糖是一類糖羥基上帶有硫酸根的多糖，與非硫酸酯多糖相比具有多方面的生物活性。硫酸酯化多糖除已證實(shí)具有抗凝血作用外，近年來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)還具有其他多種生物活性，如增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗病毒等，因此，硫酸酯化多糖的研究也受到了極大的關(guān)注［1-2］。目前，各種植物多糖如香菇多糖、黃芪多糖、淫羊藿多糖等的硫酸化修飾的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，對(duì)其硫酸化方法、硫酸酯的結(jié)構(gòu)以及活性都進(jìn)行了較深入的研究［3-5］。

然而，對(duì)動(dòng)物多糖的硫酸化修飾方面的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。另外，目前的研究大都以結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖作為修飾物，在其構(gòu)效關(guān)系方面的研究影響因素較多，不易闡明。因此，本文以扇貝糖原（scallop muscle glycogen，SMG）為研究對(duì)象，建立貝類動(dòng)物糖原的硫酸化方法，糖原所具有的單純結(jié)構(gòu)為研究硫酸化修飾對(duì)多糖的多方面影響提供了有利的基礎(chǔ)，也為貝類糖原的開(kāi)發(fā)利用提供思路。通過(guò)對(duì)扇貝糖原硫酸化修飾條件的優(yōu)化，以期得到最佳工藝條件，為研究其活性及其構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

新鮮蝦夷扇貝，購(gòu)于大連市春柳市場(chǎng)；胃蛋白酶，分析純，上海生工生物工程有限公司；明膠，優(yōu)級(jí)純，上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

Agilent 6890N 型氣相色譜儀，Agilent公司；傅里葉變換紅外光譜儀SPECTRUM ONE-B，Perkin Elmer公司；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LG-1.0真空冷凍干燥機(jī)，沈陽(yáng)航天新陽(yáng)速凍設(shè)備制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 扇貝糖原的制備

將新鮮的蝦夷扇貝取貝柱洗凈，冷凍干燥，粉碎。用胃蛋白酶酶解樣品提取糖原，酶解條件為：料液比1∶30（g/mL），加酶量為底物質(zhì)量的2.0%，pH 2.0，溫度37 ℃，酶解時(shí)間為2h。酶解液經(jīng)4 000r/min離心10min，取上清液加入3倍體積95% 乙醇，醇沉過(guò)夜。醇沉液離心（4 000r/min，10min）后，收集沉淀，加少量去離子水使其復(fù)溶、離心，上清液凍干得扇貝粗糖原。

采用木瓜蛋白酶結(jié)合Sevag法除蛋白，直到無(wú)游離蛋白出現(xiàn)為止，收集上清液。裝入截留分子質(zhì)量為7ku透析袋內(nèi)，流動(dòng)水透析24h，去離子水透析24h。反復(fù)凍融至離心無(wú)沉淀出現(xiàn)，冷凍干燥后得扇貝糖原，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 扇貝糖原的單糖組成分析

依照文獻(xiàn)［6］的方法對(duì)扇貝糖原進(jìn)行水解和乙?；褂脷庀嗌V進(jìn)行單糖組成分析。

1.3.3 扇貝糖原的紅外光譜分析

以m（樣品）∶m（KBr）=1∶100的比例混合研細(xì)后，以KBr為本底，在4 000～400cm-1掃描紅外吸收。

1.3.4 糖含量及硫酸根含量檢測(cè)

糖含量檢測(cè)：采用苯酚-硫酸法［7］進(jìn)行檢測(cè)。

硫酸根含量檢測(cè)：采用氯化鋇-明膠法［8］進(jìn)行檢測(cè)。硫酸取代度公式為

1.3.5 扇貝糖原的硫酸酯化方法

扇貝糖原的硫酸酯化采用氯磺酸-吡啶法［5］。將25mL無(wú)水吡啶加入三頸燒瓶置冰鹽浴中，按設(shè)定的氯磺酸-吡啶體積比邊攪拌邊逐滴加入氯磺酸，于40 min 內(nèi)加完。稱取一定量的扇貝糖原，溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺中，充分?jǐn)噭蚝?，加入裝有酯化試劑的三頸燒瓶中，按設(shè)定的水浴溫度和反應(yīng)時(shí)間攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后中和至pH 7.0，醇沉，離心取沉淀。復(fù)溶于水，透析，冷凍干燥得扇貝糖原硫酸酯（sulfated scallop muscle glycogen，SSMG）。

1.3.6 酯化試劑對(duì)扇貝糖原硫酸化修飾的影響

稱取200mg樣品，按照“1.3.5”的方法，調(diào)節(jié)氯磺酸與吡啶的體積比為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，將反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間分別固定在60 ℃和2h，測(cè)定DS和糖含量。

1.3.7 反應(yīng)溫度對(duì)扇貝糖原硫酸化修飾的影響

稱取200mg樣品，按照“1.3.5”的方法，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度為50、60、70、80、90℃，將氯磺酸與吡啶的體積比固定為1∶5，反應(yīng)時(shí)間固定為2h，測(cè)定DS和糖含量。

1.3.8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)扇貝糖原硫酸化修飾的影響

稱取200mg樣品，按照“1.3.5”的方法，調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)間為1、2、3、4、5h，將氯磺酸與吡啶的體積比固定為1∶5，反應(yīng)溫度固定為70 ℃，測(cè)定DS和糖含量。

1.3.9 扇貝糖原硫酸化修飾條件的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選出最佳試驗(yàn)條件，采用正交試驗(yàn)法確定扇貝糖原硫酸酯化的工藝條件。稱取500mg 樣品，按照氯磺酸與吡啶的體積比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間作三因素三水平L9（33）正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 The factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 扇貝糖原的提取及單糖組成

扇貝貝柱干粉經(jīng)過(guò)胃蛋白酶提取及除蛋白步驟，扇貝糖原的得率為13.78%，其中糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.62%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為1.4%。

扇貝糖原經(jīng)酸水解后，其乙?；苌锏臍庀嗌V分析結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1 中只出現(xiàn)兩個(gè)峰，與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間相比，除內(nèi)標(biāo)肌醇外，其中只含葡萄糖。由此可知其基本組成僅為葡萄糖，為典型的糖原單糖組成特征。

圖1 扇貝糖原單糖組成的氣相色譜圖Fig.1 GC analysis of monosaccharide composition of SMG

2.2 扇貝糖原及其硫酸酯的紅外光譜分析

對(duì)比扇貝糖原和扇貝糖原硫酸酯的紅外光譜可知（圖2），兩者均表現(xiàn)出一些糖的特征性吸收峰：在3 444cm-1附近有一強(qiáng)且寬的吸收峰，表明有糖上的O—H 鍵伸縮振動(dòng)；1 022cm-1附近有強(qiáng)吸收，表示有糖上的O—H 鍵變角振動(dòng)。所不同之處在于糖原經(jīng)過(guò)硫酸酯化修飾后SSMG 在1 228cm-1出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)的吸收峰，為 S==O 伸縮振動(dòng)的特征吸收峰；在800～1 000cm-1附近有一組C—O—S伸縮振動(dòng)吸收峰［7］。紅外光譜分析表明扇貝糖原經(jīng)過(guò)硫酸酯化修飾后其糖基已經(jīng)被硫酸基所修飾表現(xiàn)出特有的硫酸基修飾信號(hào)峰。

圖2 扇貝糖原及其硫酸酯的紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum of SMG and SSMG

2.3 扇貝糖原硫酸酯化反應(yīng)單因素的確定

2.3.1 酯化試劑對(duì)扇貝糖原硫酸化修飾的影響

由表2可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間確定的情況下，DS的大小隨著氯磺酸與吡啶的體積比的增大有起伏變化，在體積比為1∶5時(shí)，DS最高；糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著氯磺酸與吡啶的體積比的增大變化不是很大。主要是因?yàn)槁然撬釋儆趶?qiáng)酸性物質(zhì)，隨著體積比的增加對(duì)糖原糖鏈的降解作用增強(qiáng)。

表2 酯化試劑比例對(duì)硫酸化修飾的影響Tab.2 Effects of reagent proportion on the sulfating modification

2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)扇貝糖原硫酸化修飾的影響

由表3可以看出，當(dāng)酯化試劑體積比和反應(yīng)時(shí)間確定的情況下，DS的大小隨著反應(yīng)溫度的升高起伏較大，在70 ℃時(shí)DS最大。糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著反應(yīng)溫度的增加，有所減小但相差不大。因?yàn)樯蓉愄窃诟邷氐乃嵝原h(huán)境下容易降解，硫酸化程度高。

表3 反應(yīng)溫度對(duì)硫酸化修飾的影響Tab.3 Effects of reaction temperature on the sulfating modification

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)扇貝糖原硫酸化修飾的影響

由表4可以看出，當(dāng)酯化試劑體積比和反應(yīng)溫度確定的情況下，DS的大小隨著反應(yīng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)明顯的先增大后減小的趨勢(shì)，在反應(yīng)時(shí)間為3h時(shí)DS出現(xiàn)峰值為1.81；糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間的增大，變化趨勢(shì)不是很明顯?？梢?jiàn)反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖分解的影響不是很大。主要是隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，酯化試劑與糖原的反應(yīng)越完全，取代度越大。

2.4 扇貝糖原硫酸酯化工藝條件優(yōu)化結(jié)果與分析

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)（表1）。正交試驗(yàn)所得的硫酸根取代度與糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果及其極差分析（表5）。

表4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)硫酸化修飾的影響Tab.4 Effects of reaction time on the sulfating modification

從表5的極差分析可以看出，對(duì)于以取代度為指標(biāo)來(lái)說(shuō)，因素影響程度大小為B＞A＞C，反應(yīng)溫度因素的極差最大為0.63，即說(shuō)明反應(yīng)溫度對(duì)硫酸化試驗(yàn)的影響最大，氯磺酸與吡啶的體積比次之為0.62，反應(yīng)時(shí)間的影響最小為0.56。各因素的取代度極差分析表明，氯磺酸與吡啶的體積比的取代度極差最大為k2（1.59），反應(yīng)溫度的取代度極差最大為k1（1.64），反應(yīng)時(shí)間的取代度極差最大為k2（1.61），所以扇貝糖原硫酸化反應(yīng)條件的最佳組合為A2B1C2，即最佳試驗(yàn)條件為氯磺酸與吡啶的體積比為1∶5，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為3h。

表5 硫酸酯化工藝條件優(yōu)化結(jié)果Tab.5 The result of optimization sulfated factor

3 結(jié)論

（1）采用胃蛋白酶提取扇貝糖原，其得率為13.78%，其中糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.62%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.4%。

（2）紅外光譜分析表明，硫酸基與扇貝糖原形成硫酸酯化合物，采取氯磺酸-吡啶法對(duì)扇貝糖原進(jìn)行硫酸化效果較好。

（3）扇貝糖原硫酸化修飾的最佳條件為：氯磺酸與吡啶的體積比為1∶5，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為3h。