1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮衍生化寡糖的HPLC－ESI／MS在線聯(lián)用分析

張 萍，王仲孚，黃琳娟

（1.咸陽師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069）

1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮衍生化寡糖的HPLC－ESI／MS在線聯(lián)用分析

張 萍1，2，王仲孚2，黃琳娟2

（1.咸陽師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069）

為了給寡糖質(zhì)量控制和分析研究提供方法參考，對(duì)1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PPMP）衍生化試劑在液相色譜（HPLC）和電噴霧質(zhì)譜（ESI－MS）技術(shù)分析寡糖中的應(yīng)用進(jìn)行研究。用PPMP試劑在氨水介質(zhì)中對(duì)葡寡糖鏈進(jìn)行衍生化，衍生化產(chǎn)物用RP－HPLC分離，ESI－MS分析。實(shí)驗(yàn)表明：在確定的衍生化條件下，PPMP和寡糖的衍生化主產(chǎn)物為單分子標(biāo)記物，葡寡糖混合物的單分子PPMP衍生物在ESI－MS的正負(fù)離子模式下均有較好的響應(yīng)，并且在RP－HPLC柱上能夠?qū)崿F(xiàn)很好地分離。據(jù)此建立了PPMP柱前衍生，HPLC－ESI／MS在線聯(lián)用分析寡糖混合物組成的方法。該方法定性準(zhǔn)確、樣品處理簡(jiǎn)單、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為寡糖樣品的質(zhì)量控制、構(gòu)效關(guān)系研究等方面的一種測(cè)試方法。

高效液相色譜；電噴霧電離質(zhì)譜；1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮；衍生化；寡糖

寡糖（oligosaccharide）又稱寡聚糖或低聚糖，一般是由2至10個(gè)單糖縮合而成的聚合物［1－3］。近年來隨著分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等前沿交叉學(xué)科的發(fā)展，人們對(duì)寡糖構(gòu)效關(guān)系的認(rèn)識(shí)逐漸提高，寡糖成為近年來研究的熱點(diǎn)。研究表明許多寡糖具有低熱、穩(wěn)定、安全無毒、無殘留等理化性質(zhì)，能夠抑制細(xì)菌、提高機(jī)體免疫能力、降低血清膽固醇、抗病毒和抑制腫瘤細(xì)胞［1－7］，在疾病診斷與預(yù)防、營(yíng)養(yǎng)與保健、畜牧養(yǎng)殖、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)及抗病毒等方面有巨大的應(yīng)用潛力［8］。由于糖類化合物本身水溶性強(qiáng)、極性較高、成分復(fù)雜、無明顯的光學(xué)吸收，使其分析檢測(cè)存在很大的困難。到目前為止，用于寡糖分析的方法有薄層色譜法（TLC）、毛細(xì)管電泳法（CE）、糖電泳法、高效液相色譜法（HPLC）以及質(zhì)譜法［9－14］。其 中 HPLC、生 物 質(zhì) 譜 （MS）以 及HPLC－MS聯(lián)用技術(shù)是目前分析寡糖強(qiáng)有力的工具［13－16］。對(duì)寡糖進(jìn)行衍生化可以改善寡糖的疏水性、光學(xué)吸收和質(zhì)譜檢測(cè)的離子化效率，增強(qiáng) HPLC和 MS分析的靈敏度［17－19］。

1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PPMP）是本研究組合成的一種1，3－取代吡唑啉酮類試劑，是傳統(tǒng)糖類衍生試劑PMP（1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮）的類似物。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)現(xiàn)PPMP柱前衍生－HPLC－ESI／MS分析單糖混合物［20］的基礎(chǔ)上，以葡寡糖為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將PPMP衍生化擴(kuò)展到對(duì)寡糖的柱前衍生 HPLC－ESI／MS分析的研究上，以期為寡糖的分析提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Thermo LTQ XL型高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，配有Finnigan Surveyor PDA檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器以及四元梯度泵、電噴霧電離源（ESI）、離子阱質(zhì)量分析器。

1.2 主要材料與試劑

1－（4－異丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮：自制，HPLC測(cè)定純度大于99.2%；葡寡糖混合物，又名麥芽糊精（maltodextrin）：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇：色譜純，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；二氯甲烷、氨水、乙酸銨等：均為分析純，天津第三化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 HPLC 條件 采用 Symmetry Shield RP18（4.5m×250mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：0.01mol／L NH4Ac溶液（pH 4.5）和乙腈的混合溶液；梯度洗脫；柱溫37℃；流速800μL／min；UV檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm；進(jìn)樣量10μL。

1.3.2 質(zhì)譜（ESI－MS）條件 鞘氣流速12L／min；輔助氣1.5L／min；毛細(xì)管溫度375℃；正離子模式下，噴霧電壓5kV，毛細(xì)管電壓48V，透鏡電壓80V；負(fù)離子模式下，噴霧電壓5kV，毛細(xì)管電壓－48V，透鏡電壓－120V；HPLC、ESI－MS聯(lián)用時(shí)，流動(dòng)相在流經(jīng)UV檢測(cè)器后采用分流比1∶4進(jìn)入MS分析。

1.4 標(biāo)記衍生化

準(zhǔn)確稱取1.0mg的葡寡糖maltodextrin于5mL反應(yīng)瓶中，用100μL Mill－Q水充分溶解，加入100μL 0.1mol／L的PPMP甲醇溶液和50μL的氨水，渦旋混勻后，在80℃水浴反應(yīng)70 min，N2吹干，加1.0mL Mill－Q 水和1.0mL CH2Cl2充分溶解并震蕩、離心，棄去下層CH2Cl2相，同法用CH2Cl2萃取水相3次，以去除過量的PPMP試劑，水相即為PPMP衍生化的maltodextrin混合物試液。以13 000r／min高速離心后，取兩等份，分別用于ESI－MS及HPLC聯(lián)用分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

由于1，3取代的吡唑啉酮試劑的吡唑酮環(huán)上C4位存在α氫，在堿性環(huán)境下離去成為烯醇式負(fù)離子，和糖類物質(zhì)的還原端進(jìn)行醛酮之間的縮合反應(yīng)，在加熱條件下失水成為具有α，β不飽和酮結(jié)構(gòu)的單分子衍生物。此單分子衍生物會(huì)繼續(xù)與另一分子吡唑啉酮試劑的烯醇式負(fù)離子進(jìn)行Michael 1，4加成反應(yīng)，從而也可能使糖類物質(zhì)標(biāo)記上2分子吡唑啉酮試劑。反應(yīng)式示于圖1。

圖1 PPMP與還原性寡糖的衍生化反應(yīng)原理Fig.1 Derivatization reaction mechanism of oligosaccharides with PPMP

由于Michael 1，4加成是一個(gè)受溫度控制的可逆反應(yīng)，產(chǎn)物可能有單分子PPMP和雙分子PPMP兩種衍生產(chǎn)物，實(shí)際中控制合適的反應(yīng)條件，可使反應(yīng)向主產(chǎn)物方向進(jìn)行。由于單分子PPMP衍生物比雙分子PPMP衍生物具有較好的穩(wěn)定性，本研究組已經(jīng)探索出單糖與PPMP生成單分子衍生物的條件［20］，即還原單糖與PPMP的物質(zhì)的量之比為1∶6～1∶7，反應(yīng)溫度80℃，反應(yīng)時(shí)間70min。在此條件下，按照1.4衍生化步驟，對(duì)葡寡糖進(jìn)行PPMP衍生化，產(chǎn)物經(jīng)ESI－MS檢測(cè)，證實(shí)了該條件下衍生化主產(chǎn)物仍為單分子PPMP標(biāo)記物。

2.2 寡糖混合物的HPLC－ESI／MS分析方法的建立

2.2.1 PPMP標(biāo)記的葡寡糖（maltodextrin）衍生物的ESI－MS分析 取少量PPMP衍生化的葡寡糖混合物，用水稀釋10倍后，通過蠕動(dòng)泵進(jìn)ESI－MS分析，以PPMP標(biāo)記的聚合度（Dp）為1的葡寡糖衍生物的分子離子峰［Glc＋PPMP＋H］＋m／z379.0為基準(zhǔn)，對(duì)MS儀正離子檢測(cè)模式下的參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)調(diào)諧和優(yōu)化，得出ESI－MS正離子檢測(cè)PPMP－葡寡糖衍生物的最優(yōu)條件為：鞘氣流速12L／min，輔助氣流速1.5L／min，噴霧電壓5kV，毛細(xì)管溫度300℃，毛細(xì)管電壓48V，透鏡電壓80V。同樣，以PPMP標(biāo)記的聚合度（Dp）為1的葡寡糖衍生物的分子離子峰［Glc＋PPMP－H］－的 m／z 376.8為基準(zhǔn)，對(duì)MS儀負(fù)離子檢測(cè)模式下的參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)調(diào)諧和優(yōu)化，得出ESI－MS負(fù)離子檢測(cè)PPMP－葡寡糖衍生物的最優(yōu)條件為：鞘氣流速12L／min，輔助氣流速1.5L／min，噴霧電壓5kV，毛細(xì)管溫度375℃，毛細(xì)管電壓－48V，透鏡電壓－120 V。此條件下測(cè)得的PPMP衍生的葡寡糖混合物在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的MS圖示于圖2。由圖2可見，在PPMP衍生的葡寡糖混合物的MS圖上均檢出了17個(gè)分子質(zhì)量相差162Da（1個(gè)葡萄糖殘基）豐度明顯的峰。在正離子模式檢測(cè)圖上依次歸屬為單分子PPMP衍生的聚合度（Dp）為1～17的葡寡糖衍生物的［M＋PPMP＋H］＋峰，在負(fù)離子模式檢測(cè)圖上依次歸屬為單分子PPMP標(biāo)記的Dp1～Dp17的葡寡糖衍生物的［M＋PPMP－H］－峰。說明在單糖的衍生化條件下，PPMP和寡糖也可以實(shí)現(xiàn)衍生化，衍生化產(chǎn)物仍為單分子衍生物。圖中相對(duì)分子質(zhì)量為2 000以后的糖鏈MS信號(hào)變?nèi)酰环矫婵赡苁怯捎诰酆隙容^大的寡糖含量較低；另一方面是由于本實(shí)驗(yàn)使用的質(zhì)譜儀在m／z 2 000以后的高質(zhì)量端本身靈敏度較低。由圖2還可以看出，同一聚合度寡糖的正負(fù)離子模式檢測(cè)到的質(zhì)譜峰能夠一一對(duì)應(yīng)，吻合較好，說明單分子PPMP衍生的寡糖在ESI－MS的正負(fù)離子檢測(cè)模式下均有很好的響應(yīng)，兼顧兩者能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)寡糖的準(zhǔn)確分析。據(jù)此說明PPMP衍生化可以用于寡糖樣品的衍生和質(zhì)譜分析。

圖2 PPMP標(biāo)記的maltodextrin混合物的ESI－MS圖Fig.2 ESI－MS profile of PPMP labeled maltodextrin mixture

2.2.2 PPMP標(biāo)記的葡寡糖（maltodextrin）衍生物的HPLC分離 為了證實(shí)單分子PPMP衍生的寡糖在反相色譜柱上的保留能力，本研究選用Symmetry Shield RP18（4.5m× 250mm，5μm）色譜柱，對(duì)PPMP標(biāo)記的葡寡糖樣品進(jìn)行HPLC分離，梯度洗脫程序?yàn)椋?0%ACN （0 min）～20%ACN （60min）～50%ACN （70 min）～50%ACN （130min）＋10mmol／L NH4Ac溶液 （pH 4.5），在優(yōu)化的色譜條件下得到的色譜圖示于圖3。由圖3可見，PPMP衍生的寡糖混合物被分離為前后兩組區(qū)域的峰，即0～40min內(nèi)出現(xiàn)的I區(qū)峰和80～120min內(nèi)出現(xiàn)的II區(qū)峰。未去除干凈的PPMP在兩個(gè)區(qū)域中間出峰。根據(jù)衍生原理可推測(cè)，I區(qū)峰組為單分子PPMP衍生的葡寡糖，由于1分子寡糖只標(biāo)記了1分子PPMP，衍生物的極性相對(duì)于雙分子衍生物來說偏大，反相色譜保留能力相對(duì)較弱，優(yōu)先出峰；而II區(qū)峰組為雙分子PPMP衍生的葡寡糖，由于1分子寡糖標(biāo)記了2分子PPMP，衍生物的極性較小，反相保留能力較強(qiáng)，因而較晚出峰。由于雙分子PPMP衍生物比單分子衍生物具有高出1倍的UV響應(yīng)值，盡管有少量存在，也會(huì)表現(xiàn)出明顯的色譜信號(hào)峰。但就本實(shí)驗(yàn)來說，這些雙分子衍生副產(chǎn)物與單分子衍生主產(chǎn)物在保留時(shí)間上相差40min，不會(huì)影響主產(chǎn)物的分析。由圖3還可看出，I區(qū)峰組比II區(qū)峰組有較好的分離度，說明單分子PPMP衍生物比雙分子PPMP衍生物更適于反相色譜模式的分離。

圖3 PPMP標(biāo)記的maltodextrin混合物的RP－HPLC圖Fig.3 RP－HPLC chromatogram of PPMP labeled maltodextrin mixture

2.2.3 PPMP標(biāo)記的葡寡糖衍生物的HPLCESI／MS在線聯(lián)用分析 為了對(duì)PPMP－葡寡糖衍生物做進(jìn)一步確認(rèn)分析，本研究利用1.2色譜分離條件，結(jié)合2.2.1的正離子模式檢測(cè)的質(zhì)譜條件，設(shè)定流動(dòng)相在流經(jīng)UV檢測(cè)器后采用分流比1∶4進(jìn)入ESI－MS分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)PPMP－葡寡糖衍生物的 HPLC－ESI／MS在線聯(lián)用分析。對(duì)I區(qū)峰組分析的HPLC－ESI／MS聯(lián)用檢測(cè)圖示于圖4。由圖4可見，HPLC上檢測(cè)出的17個(gè)色譜峰，被ESI－MS依次在線檢測(cè)為聚合度為Dp1～Dp17葡寡糖的單分子PPMP衍生物的分子離子［M＋H］＋、［M＋Na］＋或［M＋K］＋峰，這與2.2.1中衍生物直接進(jìn)ESI－MS單獨(dú)分析的結(jié)果一致。證明單分子PPMP－葡寡糖衍生物能夠很好地實(shí)現(xiàn)HPLC和MS的在線聯(lián)用分析。對(duì)II區(qū)峰組分析也得到了類似的Dp1～Dp17的雙分子PPMP－葡聚糖衍生物的分子離子峰，如 m／z 617（Dp1）、m／z 779（Dp2）、m／z 941（Dp3）等 ［M＋Na］＋峰，因其 MS圖信號(hào)微弱，此處省略MS圖。

據(jù)此，本工作建立的PPMP柱前衍生化HPLC－ESI／MS在線聯(lián)用分析葡寡糖混合物組成的方法可以為寡糖的分析提供參考。

3 結(jié) 論

在反應(yīng)溫度80℃，反應(yīng)時(shí)間70min，PPMP過量6～7倍、氨水作為堿性介質(zhì)的條件下，PPMP和葡寡糖的衍生化主產(chǎn)物為單分子衍生物。此單分子PPMP衍生物在ESI－MS的正負(fù)離子模式下均有較好的響應(yīng)，并且混合物在RPHPLC柱上能實(shí)現(xiàn)很好地分離。據(jù)此，建立了PPMP柱前衍生化HPLC－ESI／MS在線聯(lián)用定性分析葡寡糖混合物組成的方法，該法兼顧了HPLC的高效分離和MS的高靈敏度、定性準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，具有樣品處理簡(jiǎn)單、分析速度快、分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可作為寡糖樣品在質(zhì)量控制、構(gòu)效關(guān)系研究等方面的方法參考。

圖4 PPMP標(biāo)記的葡寡糖（maltodextrin）衍生物的HPLC－ESI／MS圖（均為正離子模式檢測(cè)）Fig.4 HPLC－ESI／MS profile of PPMP labeled maltodextrin mixture

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Analysis of Oligosaccharides Labeled with 1－（4－Isopropyl）phenyl－3－methyl－5－pyrazolone Using HPLC Coupled with On－line ESI－MS Techniques

ZHANG Ping，WANG Zhong－fu，HUANG Lin－juan
（1.Chemistry and Chemical Engineering School，Xianyang Normal University，Xianyang712000，China；2.The College of Life Sciences，Northwest University，Xi’an710069，China）

Maltodextrin was derivatized with 1－（4－isopropyl）phenyl－3－methyl－5－pyrazolone（PPMP）in aqueous ammonia and derivatization products were analyzed by RP－HPLC separation and ESI－MS identification.The results indicated that mono－PPMP derivatives are still principal product for oligosaccharides.The mono－PPMP－derivatives for oligosaccharides from maltodextrins show satisfactory response to ESI－MS both in positive－ion mode and in negative－ion mode.The mixture of oligosaccharides derivatives with degree of polymerization 1—17was successfully separated by RP－HPLC.A new method for detecting thecomposition of oligosaccharides mixture with PPMP pre－column derivatization by HPLC coupled with on－line ESI－MS techniques was established.The method shows following merits：simple treatment for sample，fast analysis and accurate qualitation，and it can be used as a reference method for research of oligosaccharides’quality control and structure function relationship.

high performance liquid chromatography（HPLC）；electrospray ionization mass spectrometry（ESI－MS）；1－（4－isopropyl）phenyl－3－methyl－5－pyrazolone （PPMP）；derivatization；oligosaccharide

O 657.63

A

1004－2997（2012）04－0225－07

2012－04－05；

2012－05－30

國(guó)家自然科學(xué)基金（31170773）、陜西省科技廳自然科學(xué)基金（2012JQ2014）、陜西省教育廳自然科學(xué)基金（2010JK894）、咸陽師范學(xué)院科研基金（11XSYK103）資助

張 萍（1977～），女（漢），陜西華縣人，講師，博士，主要研究方向?yàn)樘巧飳W(xué)與糖化學(xué)。Email：zhp4190＠163.com

黃琳娟（1969～），女（漢），教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樘巧飳W(xué)與糖化學(xué)。E－mail：huanglj＠nwu.edu.cn