Semi－LC／MS技術快速定量分析黃芪樣品中黃芪甲苷含量

鄭 重，宋鳳瑞，劉 舒，趙先恩，劉志強，劉淑瑩

（1.中國科學院長春應用化學研究所，長春質譜中心，吉林 長春 130022；2.中國科學院研究生院，北京 100049）

Semi－LC／MS技術快速定量分析黃芪樣品中黃芪甲苷含量

鄭 重1，2，宋鳳瑞1，劉 舒1，2，趙先恩1，劉志強1，劉淑瑩1

（1.中國科學院長春應用化學研究所，長春質譜中心，吉林 長春 130022；2.中國科學院研究生院，北京 100049）

為了測定黃芪中的黃芪甲苷含量，應用半高效液相色譜－質譜串聯技術（Semi－LC／MS），以薯蕷皂苷為內標化合物，僅用一段色譜保護柱分離掉大部分干擾性成分，同時使目標化合物富集，采用Waters公司的多反應監(jiān)測（MRM）掃描模式檢測。結果表明：黃芪甲苷在2.85～57.0mg／L的范圍內線性關系良好，穩(wěn)定性和重復性實驗RSD＜3%，樣品回收率達98.9%。Semi－LC／MS方法可以對黃芪樣品中黃芪甲苷進行快速定量分析，是一種黃芪甲苷的簡單、高效、靈敏的定量檢測方法。

黃芪甲苷；半高效液相色譜－質譜串聯技術（Semi－LC／MS）；多反應監(jiān)測（MRM）；定量分析

黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao、膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）的根，具有補氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效［1］，含皂甙、多糖、多種氨基酸及硒、鋅、銅等多種微量元素。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分，是其質量控制的主要指標。黃芪甲苷的分析方法已有比色法、熒光分光光度法、薄層掃描法、HPLC 法（含 UPLC 法）、HPLC－MS法等［2－9］。其中比色 法、薄層掃描法存在定量不準確的缺點；熒光分光光度法實驗條件苛刻，對實驗者操作技能要求較高；由于黃芪甲苷吸收波長在200nm左右，給常規(guī)HPLC分析帶來挑戰(zhàn)；目前高效液相色譜－蒸發(fā)光散射（HPLC－ELSD）法是較為常用的黃芪甲苷的測定方法，但其檢測靈敏度受到蒸發(fā)光檢測器的制約，不適合微量樣品分析。本工作采用半高效液相色譜－質譜串聯技術（Semi－LC／MS）測定黃芪中的黃芪甲苷含量，優(yōu)化檢測條件，旨在建立一種簡便、快速、準確的黃芪甲苷的定量檢測方法。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Acquity Ultra Performance LC系統：美國Waters公司產品；XEVO－TQ三重四極桿質譜：美國Waters公司產品，配有 Waters Masslynx V4.1數據工作站。

1.2 主要材料與試劑

黃芪甲苷對照品：中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110781200613，供含量測定用；薯蕷皂苷標準品；黃芪藥材：購自北京同仁堂藥店、吉林大藥房、益和大藥房；乙腈：美國Fisher公司產品，色譜純；甲醇、正丁醇、氨水：分析純，均為北京化工廠產品；實驗用水為超純水。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge C18柱（2.5μm，4.6×20mm）；流動相：V（乙腈）∶V（水）＝55∶45的混合溶液；流速：0.7mL／min；柱溫：室溫；進樣體積：3μL。

1.3.2 質譜條件 以薯蕷皂苷為內標化合物，負離子模式檢測，采用多反應監(jiān)測（MRM）方式定量，毛細管電壓2.50kV，離子源溫度350℃，脫溶劑氣體流速800L／h，錐孔氣流速50L／h，碰撞氣流速0.15mL／min，得到的質譜圖示于圖1。

1.4 對照品儲備液的制備

圖1 質譜總離子流圖（a）、黃芪甲苷MRM離子流圖（b）和薯蕷皂苷MRM離子流圖（c）Fig.1 Total ion current chromatogram（a），MRM spectrum of Astragaloside（b）and MRM spectrum of Dioscin（c）

準確稱取黃芪甲苷對照品5.70mg，以甲醇溶解，并定容到10mL容量瓶中，搖勻，即得0.570g／L的黃芪甲苷對照品溶液。準確稱取薯蕷皂苷標準品10.01mg，以甲醇溶解，并定容于10mL容量瓶中，搖勻，即得1.00g／L薯蕷皂苷對照品溶液。

1.5 樣品溶液的制備

取黃芪藥材粉末4.089 2g，置索氏提取器中，加甲醇40mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4h，提取液回收溶劑并濃縮至干，加水10mL，微熱使殘渣溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，加水5mL使殘渣溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂（內徑1.5cm，長12cm），以50mL水洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇80mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解，并轉移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得待測樣品。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優(yōu)化

分別采用電噴霧正離子模式與負離子模式對黃芪甲苷與薯蕷皂苷進行分析，發(fā)現在負離子模式下兩者均有很好的質譜信號響應，所以最終確定采用負離子模式對這兩種化合物進行分析，并對其MRM條件進行了優(yōu)化，其結果列于表1。選擇其中信號最強的離子對進行定量測定。

表1 黃芪甲苷與薯蕷皂苷的MRM質譜條件Table 1 The MRM conditions ofAstragalosideandDioscin

2.2 線性關系考察

分別準確吸取濃度為2.85、5.70、11.4、14.25、28.5、42.75、57.0mg／L的黃芪甲苷對照品溶液（含0.50mg／L的薯蕷皂苷對照品內標），按1.3色譜、質譜條件測定，以對照品溶液質量濃度為橫坐標（x），黃芪甲苷峰面積與薯蕷皂苷峰面積比值為縱坐標（y）繪制校準曲線，計算回歸方程為y＝0.011 5x＋0.013 6，r2＝0.991 3，樣本含量n＝7，F＝661，黃芪甲苷在2.85～57.0mg／L的范圍內線性關系良好，其線性曲線示于圖2。

圖2 黃芪甲苷線性曲線Fig.2 The standard curve of Astragaloside

2.3 穩(wěn)定性試驗

取所制備的黃芪樣品溶液，稀釋5倍后，取200μL，加入50μL薯蕷皂苷標準品，定容于1mL容量瓶中，分別在0、2、4、8、12、24h測定黃芪甲苷的峰面積與薯蕷皂苷峰面積，計算峰面積比值的RSD為2.12%。結果表明，供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.4 重復性試驗

取同一樣品按1.5項方法制備6份樣品溶液，稀釋5倍后，取200μL，加入50μL薯蕷皂苷標準品，定容于1mL容量瓶中，分別進樣，測定黃芪甲苷峰面積與薯蕷皂苷峰面積，計算黃芪甲苷含量，RSD為2.41%。

2.5 回收率試驗

準確稱取已知含量（0.638mg／g）的黃芪藥材，共6份，分別準確加入黃芪甲苷對照品溶液（含黃芪甲苷1.425mg），按1.5項方法制備供試液，稀釋5倍后，取200μL，加入50μL薯蕷皂苷標準品，定容于1mL容量瓶中，測定并計算平均回收率為98.9%，RSD為1.77%。

2.6 樣品含量測定

采用1.5項方法，對不同批次的黃芪藥材進行處理，用1.3項色譜、質譜方法進行測定，各樣品中的黃芪甲苷的含量測定結果列于表2。

表2 黃芪中黃芪甲苷的含量測定結果（mg／g）Table 2 Content ofAstragalosideinAstragalusSamples（mg／g）

2.7 結果討論

由于質譜檢測器的高靈敏度，使得LC／MS技術在藥物定性定量分析領域有廣泛的用途［10－14］。但是由于常規(guī) HPLC消耗時間長，質譜檢測器的信號穩(wěn)定性不如紫外等常規(guī)檢測器，中藥復雜體系干擾因素較多，來自于溶劑中的噪音對信號產生干擾，這些都制約著LC／MS技術應用于藥物定量領域的發(fā)展。本試驗采用多反應監(jiān)測（MRM）掃描模式［15－21］，以母離子－子離子反應通道作為定量手段，能夠有效的排除存在于提取物中非目標化合物的干擾，因皂苷類成分在負離子模式下信噪比較高，而且碎裂能量低，故本試驗采用負離子模式檢測。試驗中曾經嘗試從自動進樣器進樣，不經過任何色譜柱，直接對待測樣品進行MRM分析，但由于提取物含有復雜的干擾性成分，在離子化過程中存在電離競爭反應，導致目標化合物離子化效率不高且重現性差；并且從進樣開始樣品在流路中一直處于擴散狀態(tài)，導致色譜峰型展寬，影響定量重現性；因此從信噪比、峰型、定量效果等方面都不能得到滿意的結果，于是采取了連接一段保護柱（Waters XBridge C18柱，2.5μm，4.6×20mm）的方案，能夠分離掉大部分干擾性成分，同時能夠使目標化合物達到富集效果。試驗中引入薯蕷皂苷作為內標化合物，進一步提升了定量穩(wěn)定性，得到了令人滿意的效果。雖然采用了Waters XBridge C182.5μm，4.6×20mm色譜柱，但是其作用僅僅為目標物富集與干擾物分離，并不需要高性能色譜柱來實現分離，同時與常規(guī)LC不同，目標物與內標化合物出峰時間均在1min之內，檢測時間可與UPLC相媲美。

3 結 論

采用Semi－LC／MS技術，多反應監(jiān)測模式，建立了黃芪藥材中黃芪甲苷的快速、準確、高靈敏的分析方法。Semi－LC法與常規(guī)HPLC法相比，能夠顯著提高分析效率、節(jié)省分析時間、減少溶劑損耗，并且質譜（MRM模式）優(yōu)秀的選擇性，能避免實際分析中的假陽性結果。

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Rapid Quantitative Analysis of Astragalosidein the Astragalus Samples by Semi－LC／MS

ZHENG Zhong1，2，SONG Feng－rui1，LIU Shu1，2，ZHAO Xian－en1，LIU Zhi－qiang1，LIU Shu－ying1
（1.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Science，Changchun130022，China；2.Graduate School of Chinese Academy of Science，Beijing100049，China）

In order to determinate the astragaloside in the astragalus by Semi－LC／MS，diosgenin is used as an internal standard compound，a chromatography guard column was used to remove most interference components and enrich the target compound which was subsequently determined by MS under multiple reaction monitoring（MRM）scanning－mode.The calibration curve is linear over the range of 2.85—57.0mg／L of astragaloside.The RSDs for the stability and reproducibility experiments are less than 3%，and sample recovery rate is 98.9%.Semi－LC／MS is one simple，efficient，sensitive method for rapid quantitative analysis of astragaloside in astragalus samples.

Astragaloside；semi－h(huán)igh performance liquid chromatography－mass spectrometry（Semi－LC／MS）；multiple reaction monitoring（MRM）；quantitative analysis

O657.63

A

1004－2997（2012）04－0208－04

2012－03－31

2012－06－13

國家自然科學基金 （20953001）、吉林省與中國科學院科技合作資金（2010SYHZ0052，2011CJT0015）項目資助

鄭 重（1978～），男（漢），吉林省長春人，助理研究員，從事天然藥物化學與有機質譜學研究。E－mail：zhengzh＠ciac.jl.cn

劉志強（1962～），男（漢），研究員，從事天然藥物化學與有機質譜學研究。E－mail：liuzq＠ciac.jl.cn