眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1表達(dá)的影響

井 歡 王守巖 王 健 王 瑩 高 原 潘 茜 于 丹 王 哲 關(guān)洪全

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽 110847)

眼針療法是我院著名老中醫(yī)彭靜山教授于70年代始創(chuàng)，是以眼眶周圍穴區(qū)為針刺點防治疾病的一種微針療法。臨床30余年的實際應(yīng)用顯示，眼針對多種急慢性疾病具有很好的療效，特別是對急性腦缺血性疾病效果突出。細(xì)胞間黏附因子1(ICAM-1)是最重要的白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子之一，在腦缺血再灌注損傷中的作用成為急性缺血性腦卒中研究的熱點。近年來的研究已經(jīng)證實腦缺血再灌注損傷后在缺血受損區(qū)有免疫細(xì)胞因子的過量表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤，過量炎癥因子的產(chǎn)生能加重神經(jīng)細(xì)胞損傷〔1〕。本實驗通過建立大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型，觀察眼針對腦組織ICAM-1表達(dá)的影響，旨在探討眼針治療腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康SPF級SD大鼠64只，雌雄不拘，體重(280±20)g，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證編號:SCXK(京)2007-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，自由飲水，攝取標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室內(nèi)溫度22℃，相對濕度45%。按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為對照組、假手術(shù)組、模型組、眼針組，每組16只。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與評價 參照文獻(xiàn)〔2〕，模型組及眼針組采用改良的線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。具體步驟:在室溫 (22℃)條件下，大鼠用 10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部消毒后正中偏右0.5 cm處縱向切開2 cm切口，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)。其中ECA需暴露出3～5 mm，ICA需分離至翼腭動脈。在ECA遠(yuǎn)端距CCA分叉處3～5 mm處結(jié)扎ECA，注意結(jié)扎用的手術(shù)線不要剪斷。再用電凝器在結(jié)扎點遠(yuǎn)心端電凝ECA，用眼科手術(shù)剪在結(jié)扎點和電凝點之間剪斷ECA。然后將ECA向鼠尾方向牽拉，使ECA和ICA成一條直線。動脈夾夾閉CCA近心端和ICA遠(yuǎn)心端，在ECA結(jié)扎點前端剪一“V”形小口，緩慢將栓塞線經(jīng)ECA插入ICA，打開ICA遠(yuǎn)心端的動脈夾。栓塞線插入深度1.8～2.2 cm。結(jié)扎ECA，逐層縫合。正常組未做處理。假手術(shù)組術(shù)式同模型組、眼針組，僅未插入釣魚線。模型組、眼針組于缺血2 h進(jìn)行再灌注，再灌注后72 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。模型的評價參照ZeaLonga 5分制評分標(biāo)準(zhǔn):0分為無癥狀;1分為不能完全伸展對側(cè)前爪;2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分為向?qū)?cè)傾倒;4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者排除。

1.2.2 眼針取穴及刺法 取13 mm毫針，眼針組于大鼠眶周2 mm 處針刺，定位參照人體取穴方法〔3，4〕，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)，見圖1。針刺手法:從眼眶邊緣1 mm部位平刺，左眼按照順時針方向，右側(cè)按逆時針方向，從該穴區(qū)起始定位線向終止定位線進(jìn)針，進(jìn)行平刺操作，刺入真皮，達(dá)到皮下組織，進(jìn)針3 mm，到終止定位線為止。留針20 min，留針10 min時用刮柄進(jìn)行刮針1次，刮針5下。治療時機(jī):眼針組于腦缺血再灌注即刻及取材前30 min分別進(jìn)行眼針治療2次。正常組、假手術(shù)組和模型組無其他處理。

1.2.3 試劑 實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。ICAM-1引物由北京華大基因公司合成。親和純化兔抗鼠ICAM-1多克隆抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.4 指標(biāo)測定 腦組織形態(tài)學(xué)觀察:10%水合氯醛(3.5 ml/kg體重)腹腔麻醉，開胸暴露心臟，先以0.9%生理鹽水200 ml灌至無血色后，再更換4%多聚甲醛200 ml進(jìn)行灌注。開顱取腦，后固定于同一固定液中6 h，腦組織取材參照腦立體定位圖譜，以Bregma點前后各0.2 mm為取材區(qū)間，常規(guī)脫水、石蠟包埋。將包埋的蠟塊作5 μm切片，蘇木素-伊紅(HE)染色將石蠟切片，常規(guī)脫蠟、乙醇梯度脫水、HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

圖1 大鼠眼針取穴示意圖

腦組織ICAM-1蛋白表達(dá)(免疫組化SABC):將上述石蠟切片按免疫組化試劑盒操作。ICAM-1以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)清晰棕褐色顆粒為陽性。使用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對采集的圖像測定陽性反應(yīng)物的灰度，每例動物隨機(jī)取3～4張切片，且各組所選部位相同。

腦組織ICAM-1蛋白表達(dá)(Western印跡法):以上述方法麻醉后斷頭取右腦梗死區(qū)半暗帶，按腦組織凈重∶裂解液=1∶10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液，pH7.5，將樣品剪碎后勻漿、離心，上清即為總蛋白。兔抗鼠ICAM-1一抗(1∶500);O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate顯色;掃描儀掃描硝酸纖維素膜(NC膜)，分析結(jié)果。

腦組織ICAM-1 mRNA的表達(dá):采用RQ-PCR方法，ICAM-1上游引物:5'CAAACGGGAGATGAATGG 3';下游引物:5'CACGAAGCCCGCAAT3'。β-actin為內(nèi)參，其上下游引物分別為:5'CGTGCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGCCGATAGTGATGACCT 3'。所有的產(chǎn)物在ABI Prism 7500 HT序列檢測系統(tǒng)中運行。讀取CT值，以管家基因β-actin為內(nèi)參，以擴(kuò)增倍數(shù)作為比較的依據(jù)，△CT=CT目的基因 -CTβ-actin，△△CT=△CT實驗-△CT對照，擴(kuò)增倍數(shù)=2-△△CT。將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物同時進(jìn)行溶解曲線分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 正常組及假手術(shù)組大鼠皮層組織細(xì)胞排列有序，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核清楚，組織間隙無異常。模型組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可見篩網(wǎng)狀壞死灶，壞死灶周圍部分區(qū)域胞體增大，染色變淡，細(xì)胞周圍水腫明顯，組織結(jié)構(gòu)疏松，可見中性粒細(xì)胞浸潤。眼針組缺血神經(jīng)元數(shù)目減少，組織結(jié)構(gòu)水腫減輕，中性粒細(xì)胞浸潤較模型組減少。

2.2 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1蛋白表達(dá)的影響 采用免疫組化方法，模型組右側(cè)額頂葉腦組織ICAM-1陽性細(xì)胞較正常組和假手術(shù)組增加，而眼針組ICAM-1陽性細(xì)胞較模型組減少(P＜0.01)。采用Western印跡方法，模型組腦組織ICAM-1蛋白表達(dá)明顯高于正常組和假手術(shù)組，眼針組ICAM-1蛋白表達(dá)明顯低于模型組(P＜0.01)。見圖2，表1。

圖2 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1蛋白表達(dá)的影響(SABC法，×400)

表1 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1蛋白表達(dá)影響(±s，n=8)

表1 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1蛋白表達(dá)影響(±s，n=8)

與正常組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 免疫組化法(灰度值) Western法(灰度值)114.78±13.54 0.35±0.02假手術(shù)組 121.65±12.55 0.37±0.04模型組 157.36±15.13 0.60±0.041)眼針組 136.41±19.382) 0.52±0.042)正常組

2.3 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響 選用β-actin作為內(nèi)參，ICAM-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為86 bp，β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物為132 bp。模型組腦組織ICAM-1 mRNA表達(dá)(3.9±0.37)較正常組(1.00±0.09)、假手術(shù)組(1.46±0.26)增加，眼針組表達(dá)(1.8±0.23)較模型組減少，均有顯著差異(P＜0.01)。

3 討論

眼針療法是彭靜山教授根據(jù)中醫(yī)學(xué)“諸經(jīng)皆屬于目”以及在后世醫(yī)家的“五輪”“八廓”理論基礎(chǔ)上，結(jié)合“八卦”學(xué)說，按照八卦方位將眼眶四周分為等份的八個區(qū)，每個區(qū)代表一個卦位，即乾、坎、艮、震、巽、離、坤、兌;在八區(qū)的基礎(chǔ)上再依據(jù)經(jīng)絡(luò)臟腑的聯(lián)屬關(guān)系配以臟腑穴區(qū)，總計十三穴區(qū)，即肺穴、大腸穴、腎穴、膀胱穴、上焦穴、肝穴、膽穴、中焦穴、心穴、小腸穴、脾穴、胃穴、下焦穴〔5〕。腦為奇恒之府，腦由髓匯集而成，故名“髓?！保X是精髓和神明高度匯集之處，有元神之府。眼與腦密切相連?！啃晤愅?，……內(nèi)有大絡(luò)六，謂心、肺、脾、肝、腎，命門各主其一;中絡(luò)八，謂膽、胃，大小腸，三焦、膀胱各主其一;外有旁支細(xì)絡(luò)莫知其數(shù)，皆懸貫于腦……〔6〕。說明眼通過經(jīng)絡(luò)與腦密切相連。在辨證基礎(chǔ)上選取相應(yīng)穴位進(jìn)行針刺，從而達(dá)到“通經(jīng)調(diào)氣血”以防治疾病的效果。30余年來臨床上運用眼針治療重疾頑癥，特別是對急性腦卒中癱瘓的療效尤為明顯。

ICAM-1屬免疫球蛋白超家族成員，與白細(xì)胞的浸潤關(guān)系密切，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。ICAM-1介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附及白細(xì)胞穿過血管壁這一復(fù)雜過程。正常情況下ICAM-1可以在內(nèi)皮細(xì)胞有低水平的表達(dá)，不會引起機(jī)體的病理性損傷;而在腦缺血等病理情況下，在細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)等刺激下表達(dá)可明顯升高，一旦缺血區(qū)域血流恢復(fù)，ICAM-1即可作為配基與白細(xì)胞上表達(dá)的淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)和巨噬細(xì)胞活化趨化因子-1(Mac-1)結(jié)合，使大量白細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附，且穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)周圍組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起一系列的病理變化，導(dǎo)致再灌注損傷〔7，8〕。本實驗結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織ICAM-1蛋白和基因表達(dá)均較正常組、假手術(shù)組升高，同時神經(jīng)功能缺損癥狀加重，說明ICAM-1參與了腦缺血再灌注損傷。而眼針治療后ICAM-1蛋白和基因表達(dá)均較模型組下降，說明眼針能減少腦缺血再灌注損傷大鼠ICAM-1表達(dá)。即通過眼針治療可以有效地減少腦梗死區(qū)ICAM-1的表達(dá)，通過減輕炎癥反應(yīng)實現(xiàn)對腦細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 Merrill JE，Benveniste EN.Cytokines in inflammatory brain lesions:helpful and harmful〔J〕.Trends Neurosci，1996;19(18):331-8.

2 馬賢德，孫宏偉，柴繼嚴(yán)，等.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009;27(6):1200-1.

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5 董文毅，彭 敏.眼針療法的研究進(jìn)展〔J〕.針灸學(xué)報，1991;3(1):48-51.

6 明·王肯堂.證治準(zhǔn)繩〔M〕.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1997:226.

7 Rigsby CS，Ergul A，Portik-Dobos V，et al.Dorrance.Effects of spironolactone on cerebral vessel structure in rats with sustained hypertension〔J〕.Am J Hyperten，2011;24(6):708-15.

8 Ishida H，Takemori K，Dote K，et al.Expression of glucose transporter-1 and aquaporin-4 in the cerebral cortex of stroke-prone spontaneously hypertensive rats in relation to the blood-brain barrier function〔J〕.Am J Hyperten，2006;19(1):33-9.