TRAIL與環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)LN215細(xì)胞凋亡的作用

張艷春 齊 玲 嚴(yán) 海 金 宏 趙東海 于洪泉

(北華大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，吉林 吉林 132013)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)作為一種新型的抗腫瘤藥物，在美國(guó)已進(jìn)入臨床Ⅱ期實(shí)驗(yàn)階段〔1〕。前期的研究發(fā)現(xiàn)，在某些惡性膠質(zhì)瘤的死亡信號(hào)誘導(dǎo)復(fù)合體(DISC)成分中，半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、死亡受體5(DR5)具有十分重要的作用〔2～4〕。因此，繼續(xù)研究其他惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性及耐藥的機(jī)制，可為T(mén)RAIL作為腫瘤治療新藥提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司);rhTRAIL(Peprotech公司);對(duì)硝基苯(上海生物工程技術(shù)公司);環(huán)磷酰胺(CPA，阿拉丁公司，中國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將配制好的DMEM/F12培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中預(yù)熱，自液氮罐中取出人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN215，迅速置于37℃水浴至融化，離心后小心吸出上清，將細(xì)胞用1 ml培養(yǎng)基混勻放入培養(yǎng)皿中，再加入9 ml新鮮培養(yǎng)基，輕輕混勻后放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，在飽和濕度下培養(yǎng)。待80% ～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 酸性磷酸酶法檢測(cè)TRAIL對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 待細(xì)胞融合至80%左右，胰酶消化后臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以8×103個(gè)/孔密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，加入不同濃度 TRAIL(0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30，100，300 ng/ml)，對(duì)照組使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。24 h后小心棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去培養(yǎng)基，每孔加入酸性磷酸酶底物檢測(cè)液(對(duì)硝基苯新鮮配制)100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)90 min，加入終止液，室溫下孵育5 min。酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)定各孔光吸收值。

1.4 酸性磷酸酶法檢測(cè)TRAIL與CPA對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用 將細(xì)胞以8×103個(gè)/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為四組，分別為T(mén)RAIL組(TRAIL 100 ng/ml)，CPA 組(CPA 10 μg/ml)，聯(lián)合用藥組(TRAIL 100 ng/ml+CPA 10 μg/ml)，對(duì)照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。余步驟同1.3。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.01為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 LN215細(xì)胞的培養(yǎng) 惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN215復(fù)蘇后培養(yǎng)，細(xì)胞在復(fù)蘇2 h開(kāi)始貼壁，初期呈現(xiàn)圓球形，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)突起，開(kāi)始呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，24 h后90%以上的細(xì)胞都已貼壁，大部分可見(jiàn)明顯的突起。

2.2 LN215細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性 圖1可見(jiàn)。經(jīng)不同濃度TRAIL作用后，細(xì)胞最初在TRAIL低濃度時(shí)無(wú)明顯的凋亡發(fā)生，甚至出現(xiàn)輕微的增殖現(xiàn)象;但當(dāng)TRAIL濃度達(dá)到1 ng/ml時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡，并隨TRAIL濃度升高，凋亡水平逐漸升高，在300 ng/ml時(shí)，凋亡率可達(dá)到12%。從 TRAIL作用于LN215細(xì)胞的結(jié)果來(lái)講，LN215是對(duì)TRAIL抵抗的細(xì)胞株。

圖1 TRAIL誘導(dǎo)LN215細(xì)胞發(fā)生凋亡情況

2.3 TRAIL聯(lián)合CPA誘導(dǎo)LN215細(xì)胞凋亡作用 LN215細(xì)胞經(jīng)TRAIL作用后，測(cè)定結(jié)果為0.29±0.02，CPA作用后檢測(cè)結(jié)果為0.23±0.01，TRAIL與CPA聯(lián)合作用檢測(cè)結(jié)果為0.11±0.01，與對(duì)照組(0.29±0.02)相比具有顯著性差異(P＜0.01)。

3 討論

自2007年以來(lái)，癌癥已成為危脅人類生命健康的最大殺手。癌癥的最佳治療目標(biāo)是觸發(fā)腫瘤發(fā)生自發(fā)選擇性細(xì)胞死亡，而不引起其他組織的損傷。然而，在癌細(xì)胞不斷追求生存、阻礙細(xì)胞死亡的進(jìn)程中，往往會(huì)發(fā)生腫瘤細(xì)胞耐藥，這就是癌癥對(duì)放療和化療發(fā)生抵抗的原因〔5〕。TRAIL可選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，對(duì)正常的組織細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性作用〔1〕。

研究表明，大部分惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡發(fā)生耐藥〔6〕。本研究也發(fā)現(xiàn)，因此，LN215是TRAIL耐藥細(xì)胞株。進(jìn)一步研究TRAIL與化療藥物CPA是否發(fā)生協(xié)同作用，聯(lián)合用藥組細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡反應(yīng)，而單獨(dú)用藥組則不出現(xiàn)這種反應(yīng)，這一結(jié)果有力地證實(shí)了TRAIL與化療藥物可發(fā)生協(xié)同作用。但TRAIL與化療藥物發(fā)生協(xié)同作用的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

1 Bellail AC，Qi L，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，2009;4(1):34-41.

2 Qi L，Bellail AC，Rossi MR，et al.Heterogeneity of primary glioblastoma cells in the expression of caspase-8 and the response to TRAIL-induced apoptosis〔J〕.Apoptosis，2011;16(11):1150-64.

3 齊 玲，于洪泉，金 宏，等.Caspase-8在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抵抗TRAIL誘導(dǎo)凋亡中的作用〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011;37(4):612-6.

4 南栗巖，齊 玲，肖振晶，等.原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)死亡受體與TRAIL抵抗的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(18):3591-2.

5 Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma〔J〕.N Engl J Med，2005;352(10):987-96.

6 Li YC，Tzeng CC，Song JH，et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(9):2716-29.