天龍核苷體外抗腫瘤作用的研究

宋 景 趙啟韜 高 鵬 代 龍*

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355）

天龍為壁虎科動(dòng)物無(wú)蹼壁虎Gecko swinhoana Gunther.或多疣壁虎G.japonicum Dumeril.et Bibron.的干燥全體[1]，臨床上常用于非小細(xì)胞肺癌，肝癌，腸道癌等惡性腫瘤的治療，臨床療效確切，但其抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。近幾年來(lái)研究報(bào)道，核苷類(lèi)成分具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[2-4]，極有可能是天龍抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)之一，故本課題組以天龍核苷進(jìn)行了體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，以期探究、了解天龍核苷的抗腫瘤作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2-16pk型低溫離心機(jī)（Sigma公司）；3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma scientific公司）；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司）；Nikon Eclipse Ts100型顯微鏡（日本Nikon公司）；Nikon D5000型相機(jī)（日本Nikon公司）；臺(tái)式恒溫?fù)u床（上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；細(xì)胞培養(yǎng)瓶；濾器（Jet公司）。

1.2 試藥

MTT（北京solarbio科技有限公司）；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；0.25%胰蛋白酶酶-EDTA溶液（北京solarbio科技有限公司）；DMSO（北京solarbio科技有限公司）； 順鉑（山東德州德藥制藥有限公司）。天龍核苷為本課題組自制（取干品，超純水使其溶解，無(wú)菌濾器除菌，調(diào)整濃度為10 mg/mL，4℃保存）。

1.3 腫瘤細(xì)胞株

人紅白血病細(xì)胞株K562，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549均由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所孟紅老師惠贈(zèng)。腫瘤細(xì)胞株懸液制備：腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在改良型RPMI-1640培養(yǎng)基中（含10%新生牛血清）中，置37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中，24h后換液，貼壁細(xì)胞棄去上清液，PBS沖洗2遍，0.25%胰酶-EDTA液消化細(xì)胞，再用PBS沖洗2遍（懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞直接收集），用改良型RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為每毫升含1×105個(gè)細(xì)胞的懸液，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變[5]

將腫瘤細(xì)胞株懸液接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1mL（含1×105個(gè)細(xì)胞），分別加入陰性對(duì)照劑（改良型RPMI-1640培養(yǎng)基）、不同濃度的天龍核苷液（500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）各100μL，每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)36h后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并拍攝照片。

圖1 對(duì)照組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549（10×）

圖2 藥物組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549（20×）

圖4 給藥組人紅白血病細(xì)胞K562（20×）

2.2 MTT法[6,7]

將腫瘤細(xì)胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100/μL（含1×104個(gè)細(xì)胞），分別加入陰性對(duì)照劑（改良型RPMI-1640培養(yǎng)基）、陽(yáng)性對(duì)照（順鉑，DDP，濃度為250μg/mL）以及不同濃度的天龍核苷液（500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）各10/μL，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，于培養(yǎng)結(jié)束前4h各培養(yǎng)孔加入5μg/mL MTT20/μL，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入DMSO 100/μL，置恒溫?fù)u床搖動(dòng)15min（150 rpm/min），用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，測(cè)定波長(zhǎng)λ=492nm，參考波長(zhǎng)λ=630 nm，并計(jì)算抑制率。計(jì)算公式為：抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.4 光鏡檢查細(xì)胞學(xué)形態(tài)結(jié)果

陰性對(duì)照的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞明亮清晰，折光性好，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，核較大（圖1，圖3）。而給藥組光鏡下細(xì)胞變圓變小，折光性下降，出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，染色質(zhì)濃縮致密并分裂成塊，多數(shù)細(xì)胞形成凋亡小體（圖2，圖4）。

2.5 MTT法結(jié)果

天龍核苷的體外抑瘤作用見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，天龍核苷類(lèi)成分對(duì)K562及A549細(xì)胞株均有抑制作用，并有較好量效關(guān)系。對(duì)天龍核苷敏感的最低有效濃度分別是100μg/mL、50μg/mL半數(shù)抑制率（IC50）分別是277μg/mL和298μg/mL。

表1 不同藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用[OD值(±s) /抑制率(% )]

表1 不同藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用[OD值(±s) /抑制率(% )]

注：與1640培養(yǎng)液比較，*P≤0.05，**P≤0.01

組別 濃度(μg/mL) K562 A549 1640培養(yǎng)液 - 0.843±0.035/0 0.801±0.057/0 DDP 250 0.275±0.021/67.4** 0.224±0.012/72.0**天龍核苷 500 0.364±0.025/56.9** 0.358±0.016/55.4**250 0.447±0.028/46.9** 0.432±0.033/46.1**100 0.520±0.016/38.3** 0.474±0.015/40.8**50 0.707±0.040/18.3* 0.574±0.042/28.4**25 0.808±0.033/4.19 0.653±0.036/18.5*

3 討 論

本課題組在研究天龍小肽類(lèi)成分時(shí)發(fā)現(xiàn)了其含有核苷，采用堿化正丁醇萃取法制備了較純的天龍核苷；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明天龍核苷具有較強(qiáng)的體外抗腫瘤作用，極有可能是其抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，下一步在進(jìn)行天龍小肽的課題基礎(chǔ)上，應(yīng)深入天龍核苷的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，以補(bǔ)充完善天龍的抗腫瘤研究。

[1] 山東省藥品監(jiān)督管理局.山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].濟(jì)南：山東友誼出版社,2002：273.

[2] 嚴(yán)林,孔軍,侯莉莉.核苷類(lèi)似物的設(shè)計(jì)合成及其抗腫瘤活性[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào),2011,41(3)：257.

[3] 王丹,王寧,葉新山.雜氮核苷類(lèi)似物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物化學(xué)雜志,2010,20(4)：319.

[4] 史麗宏,金東哲,周偉澄,等.3'-甲基呋喃核苷衍生物的設(shè)計(jì)合成與抗腫瘤活性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2009,44(7)：747.

[5] 宋宇.吳茱萸堿抗腫瘤作用及其作用機(jī)制的研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2005.

[6] Vistica DT, Skenhan P, Seudiero D, et a.l Tetrazolium-based as says for cellular viability： a critical examination of selected parameters affecting formazan production [J]. Cancer Res,1991,51(10)：2515.

[7] Walencka E, Sadowska B, Rozalska S, et a.l Lysostaphin as a potential the rapeuticagent for staphylococcal biofilm eradication[J].Pol JMicrobio,2005,54(3)：191.