DPD為底物評(píng)價(jià)Fe3O4納米粒子分解H2O2的催化活性

王 宇

(“光電帶隙材料”省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱師范大學(xué))

0 引言

過氧化氫在環(huán)境化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)中是很重要的一種活性中間體，其濃度的檢測(cè)在化學(xué)分析、環(huán)境分析及生物分析等領(lǐng)域都有著重要的研究意義［1］.目前，過氧化氫的檢測(cè)方法有很多，例如，分光光度法［2-4］、熒光分析法［5］、電分析法［6］和化學(xué)發(fā)光法［7-8］等.

Bader于1988年提出了DPD法測(cè)量水中低濃度H2O2的研究結(jié)果［9］.與其他分光光度法相比，DPD方法精度高、所需測(cè)量?jī)x器簡(jiǎn)單、檢出限低，一經(jīng)提出就得到了廣泛應(yīng)用［10］.基本原理是，如果溶液中有 H2O2存在，HRP催化氧化H2O2生成的產(chǎn)物會(huì)立即將DPD氧化成陽性離子基 DPD·+，DPD·+是一種粉紅色的化合物，它有兩個(gè)吸收峰，510 nm和551 nm處，通過測(cè)551 nm處的吸光度值，可計(jì)算溶液中H2O2濃度.

上述提到的DPD法是要依靠于HRP(過氧化物酶—辣根)的催化反應(yīng).但作為天然酶，HRP價(jià)格昂貴，不易長(zhǎng)期保存，且容易失活.因此，尋找人工合成的類過氧化物酶引起了研究者的關(guān)注.

Fe3O4納米粒子因特殊的理化性質(zhì)，已在化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)［11］、環(huán)境治理［12］、電傳感器［13］等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值.2007年，閻錫蘊(yùn)課題組首次發(fā)現(xiàn)Fe3O4磁性納米粒子具有類過氧化物酶的催化活性［14］.與HRP相比，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子穩(wěn)定性更具優(yōu)勢(shì).因此，該文以 Fe3O4磁性納米粒子替代 HRP，采用 DPD為底物，評(píng)價(jià)H2O2的分解程度，并檢測(cè)過氧化氫的濃度.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)、三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、過氧化氫(30%)、pH=6磷酸鹽緩沖液和pH=4.5醋酸鹽緩沖液(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，N，N-二乙基對(duì)苯二胺(DPD，上海源葉生物科技有限公司)，過氧化物酶—辣根(HRP，上海源葉生物科技有限公司).

紫外可見分光光度計(jì)(Lambda 45，美國Perkin Elmer公司);粉末X射線衍射儀(D8 Advance，德國布魯克光譜儀器公司).

1.2 Fe3O4納米粒子的制備

采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4納米粒子，制備溫度分別為室溫(RT)、60℃、100℃、140℃，經(jīng)過高速離心、篩分［15］，標(biāo)記為 CP-Fe3O4，將CP-Fe3O4粒子分散在蒸餾水中，并在140℃進(jìn)行回流處理，得到 Fe3O4磁流體，標(biāo)記為 FFFe3O4.

1.3 晶相結(jié)構(gòu)分析

采用X射線衍射儀分析樣品的晶相結(jié)構(gòu)，測(cè)試條件:CuKα靶，電壓40 kV，電流40 mA，掃描范圍 20°-90°，樣品的平均粒徑根據(jù) Sherrer公式計(jì)算.

1.4 對(duì)底物DPD的酶促動(dòng)力學(xué)表觀參數(shù)測(cè)定

取0.1 g DPD，溶于0.05 mol/L N H2SO4中，密封、避 光，5℃下保存.

取 5 mL 醋酸鈉緩沖液(pH=4.5)，0.2 mL H2O2，加入10 mg Fe3O4納米粒子，為得到線性回歸方程，分別加入不同量 DPD(5 μL，10 μL，50 μL，0.1 mL，0.5 mL，1 mL)，攪拌，充分反應(yīng)5 min后，磁分，取上清液，測(cè)551 nm處的紫外可見吸光度值，10 s后再測(cè)一次.兩次測(cè)量差值，由計(jì)算即得到不同DPD濃度下對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速度v.然后以DPD濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速度v的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，直線與x軸的截距為1/Km的絕對(duì)值，y軸的截距是1/vmax值［16］，Km米氏常數(shù)，屬于酶的特征常數(shù)，此處代表Fe3O4納米粒子與底物DPD親和力的大小，Km值越小，表明Fe3O4納米粒子與DPD的親和力越高.

1.5 溶液中H2O2濃度的檢測(cè)

取50 mL 蒸餾水，60 μL 30%H2O2，加入3 mL磷酸鹽緩沖液(pH=6)，攪拌均勻，加入50 μL DPD，10 mg Fe3O4納米粒子，攪拌 2 min，再將Fe3O4納米粒子磁分，取上清液，在450～600 nm范圍內(nèi)測(cè)紫外可見連續(xù)光譜.根據(jù)551 nm處吸光度通過公式［H2O2］=，計(jì)算各樣品中HO的分解量.其22中，A551為溶液在最大吸收波長(zhǎng)(551 nm)處的吸光度，ε=21.000M-1·cm-1，l為比色皿的口徑寬度，Vsample和Vfinal分別是測(cè)試樣品的體積與所有試劑都加入樣品后的總體積.空白對(duì)照組中不加Fe3O4納米粒子.

2 結(jié)果與討論

2.1 晶相結(jié)構(gòu)分析

圖1是Fe3O4粒子的XRD譜圖.與標(biāo)準(zhǔn)的JCPDS卡進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)所有樣品在30.10°，35.40°，43.40°，53.60°，57.30°及 62.80°均出現(xiàn)衍射峰，分別對(duì)應(yīng)于 Fe3O4相的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)晶面，說明所得產(chǎn)物均為Fe3O4.隨著制備溫度的升高，衍射峰的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而且相同制備溫度下，F(xiàn)F-Fe3O4粒子的衍射峰強(qiáng)于CP-Fe3O4粒子.

圖1 CP-Fe3O4粒子

表1 Fe3O4納米粒子的平均粒徑

表1顯示，粒子的平均粒徑隨著制備溫度的升高而減小，這可能是因?yàn)橹苽錅囟雀?，粒子的成核速度快，晶核的生長(zhǎng)速度受到抑制，所得Fe3O4粒子的平均粒徑就偏小［17］.相同制備溫度下，F(xiàn)F-Fe3O4粒子的平均粒徑小于CP-Fe3O4粒子，這說明 FF-Fe3O4粒子穩(wěn)定性優(yōu)于CPFe3O4粒子，不易團(tuán)聚.

2.2 Fe3O4納米粒子對(duì)底物DPD的酶促動(dòng)力學(xué)表觀參數(shù)

為比較Fe3O4粒子與HRP對(duì)檢測(cè)H2O2所用底物DPD的親和程度，測(cè)定了Fe3O4粒子對(duì)DPD的酶促動(dòng)力學(xué)表觀參數(shù).圖2是不同體系的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖.

圖2 不同溫度下制備的CP-Fe3O4粒子

由Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖得到的線性回歸方程計(jì)算可知，在所有Fe3O4粒子中，只有室溫、60℃下制備的CP-Fe3O4粒子與底物的親和程度差于HRP，其余Fe3O4納米粒子與檢測(cè)H2O2濃度的底物都有很強(qiáng)的親和力，而且相同制備溫度下，F(xiàn)F-Fe3O4粒子與底物DPD的親和力強(qiáng)于 CP-Fe3O4粒子.這表明，DPD適合作Fe3O4納米粒子分解H2O2的分析底物，用于檢測(cè)H2O2的濃度.

2.3 DPD為底物評(píng)價(jià) Fe3O4納米粒子分解H2O2的能力

圖3是不同體系中的紫外可見吸光譜.各體系中H2O2分解量由551nm處吸光度值計(jì)算，見表2.

圖3 DPD-H2O2體系中加入Fe3O4納米粒子后的紫外可見連續(xù)光譜

表2 各樣品中H2O2分解量 ×10-7mol/L

通過以上圖表可得，體系中未加入Fe3O4納米粒子時(shí)，H2O2與 DPD緩慢反應(yīng)，生成少量DPD·+，曲線a的吸光度較低.當(dāng)體系中加入CP-Fe3O4粒子和FF-Fe3O4粒子時(shí)，吸光度增大，且加入FF-Fe3O4粒子體系的吸光度大于加入CP-Fe3O4粒子的體系.這表明，F(xiàn)e3O4納米粒子能催化H2O2分解進(jìn)而氧化DPD生成DPD·+，體系的吸光度增大.制備溫度越高，F(xiàn)e3O4納米粒子催化分解H2O2的能力越強(qiáng).對(duì)于相同制備溫度下，F(xiàn)F-Fe3O4粒子催化分解H2O2的能力強(qiáng)于CP-Fe3O4粒子，這說明140℃蒸流水中的回流處理，促進(jìn)了Fe3O4粒子分解H2O2的能力.這可能是由于經(jīng)過140℃回流熱處理后的Fe3O4表面羥基多，表面活性較強(qiáng)［18］，分解H2O2的能力也較強(qiáng).結(jié)果也表明，所制備的Fe3O4粒子能夠檢測(cè)10-7mol/L的H2O2.

3 結(jié)論

采用共沉淀法，在不同溫度下制備出CPFe3O4粒子和FF-Fe3O4粒子，CP-Fe3O4粒子和FF-Fe3O4粒子對(duì)DPD的親和程度都很高，可以用DPD為分析底物評(píng)價(jià)Fe3O4粒子對(duì)H2O2的分解能力.不同溫度下制備出的CP-Fe3O4粒子和FF-Fe3O4粒子都具有類過氧化物酶活性，可以催化H2O2分解，制備溫度越高，F(xiàn)e3O4納米粒子平均粒徑越小，粒子催化分解H2O2的能力越強(qiáng)，并且在相同制備溫度下FF-Fe3O4粒子催化分解H2O2的能力強(qiáng)于CP-Fe3O4粒子，可以檢測(cè)1×10-7mol/L的H2O2.

［1］ Luo Y，Sui Y，Wang X，et al.2-Chlorophenol induced hydroxyl radical production in mitochondria in carassius auratus and oxidative stress—an electron paramagnetic resonance study.Chemosphere，2008，71:1260-1266.

［2］ Stefan Radl，Silvia Larisegger.Quantifying Absorption Effects during Hydrogen Peroxide Decontamination.Journal of Pharmaceutical Innovation，2011(4):202-216.

［3］ Manzoori J，Amjadi M.Application of crude extract of kohlrabi(brassica oleracea gongylodes)as a rich source of peroxidase in the spectrofluorometric determination of hydrogen peroxide in honey samples.Anal Sci，2006，22:1201-1209.

［4］ Tang B，Zhang L，Xu K.FIA– near-infrared spectrofluorimetric trace determination of hydrogen peroxide using tricarchlorobocyanine dye(Cy.7.Cl)and horseradish peroxidase(HRP).Talanta，2006，68:876-883.

［5］ Wei H，Wang EK.Fe3O4magnetic nanoparticles as peroxidase mimetics and their applications in H2O2and glucosedetection.Anal Chem ，2008，80:2250-2256.

［6］ Zhang Keying，Zhang Na.A novelnon-enzyme hydrogen peroxide sensor based on an electrode modified with carbon nanotube-wired CuO nanoflowers.Microchimica Acta，2012，176，137-142.

［7］ Yuan J，Shiller A M.Determination of subnanomolar levels of hydrogen peroxide in seawater by reagent-injection chemiluminescence detection.Anal Chem，1999，71，1975-1981.

［8］ Hanaoka S，Lin J，Yamada M.Chemiluminescent flow sensor for H2O2based on the decomposition of H2O2catalyzed by cobalt(Ⅱ)-ethanolamine complex immobilized on resin.A-nal Chim Acta，2001，426，57-63.

［9］ Bader H，Sturzenegger V，Hoigne J.Photometric method for the determinarion of low concentrations of hydrogen peroxide by the peroxidase catalyzed oxidation of N，N-diethyl-pphenylenediamine(DPD).Water Res，1988，22:1109-1115.

［10］皮運(yùn)正，王建龍.N，N-二乙基對(duì)苯二胺/辣根過氧化物酶法測(cè)定過氧化氫濃度時(shí)臭氧干擾的消除.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2005，10(33):1516-1519.

［11］ Ouyang Huixiang，Wang Lisheng.A Simple and Sensitive Nanocatalytic Fluorescence Method for the Determination of Folic Acid in Foods Using Fe3O4Nanoparticle-K2S2O8System.Food Analytical Methods.2013，6(1):76-81.

［12］ Wang Nan，Zhu Lihua.Sono-assisted preparation of highly-efficient peroxidase-like Fe3O4magnetic nanoparticles for catalytic removal of organic pollutants with H2O2.Ultrasonics Sonochemistry，2010.17:526 –533.

［13］ Zhan Xia，Zhang Hui.Sensitive electrochemical sensor for hydrogen peroxide using Fe3O4magnetic nanoparticles as a mimic for peroxidase.Microchim Acta ，2011，174:183 –189.

［14］ Gao L，Zhuang J，Nie L，et al.Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagnetic nanoparticles.Nat Nanotechnol，2007(2):577-582.

［15］王麗燕，王紅霞，王愛杰，等.磁性SiO2載體的表面改性與納米TiO2光催化劑的固載［J］.催化學(xué)報(bào)，2009，30:939-944.

［16］ Tay K S，Rahman N A.Chemical oxidation of N，N-diethyl-m-toluamide by sulfate radical-based oxidation:kinetics and mechanism of degradation.International Journal of Environmental.Science and Technology，2013，10:103-112.

［17］ Geng B Y，Ma J Z，You J H.The Effect of Ionic Liquids on Protein Crystallization and X-ray Diffraction Resolution.Cryst Growth Des，2008，8(5):1443-1447.

［18］ Chang Qing，Deng Kejian.Determination of hydrogen peroxide with the aid of peroxidase-like Fe3O4magnetic nanoparticles as the catalyst.Microchim Acta，2009，11:745-751.