長鏈非編碼RNA?；撬嵘险{(diào)基因1通過激活TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮促大鼠肝纖維化的作用①

趙 剛 徐貴穎

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,國家衛(wèi)生健康委員會放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130021)

肝纖維化屬于可逆性病變，是進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是慢性肝病共同的病理特征。肝纖維化的特征為細(xì)胞外基質(zhì)(尤其是膠原)在肝臟內(nèi)的大量沉積。肝星狀細(xì)胞的活化在肝纖維化的發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，活化的肝星狀細(xì)胞可分泌α-SMA、collagenⅠ、TIMP-1等[1，2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是近年來RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，其可通過多種機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)，?；撬嵘险{(diào)基因(taurine up-regulated gene 1,TUG1)是lncRNA的重要成員之一，是缺氧引起的肺纖維化調(diào)節(jié)因子，也是心肌成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要調(diào)節(jié)因子，但其在肝纖維化中的作用尚不清楚[3，4]。本文對肝纖維化組織和活化肝星狀細(xì)胞中TUG1的表達(dá)情況及其在肝纖維化中的可能作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級SD大鼠75只，雄性，體質(zhì)量160～190 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2008-0016。

1.1.2主要試劑與儀器 肝星狀細(xì)胞株HSC-T6(復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心)；兔抗α-SMA單克隆抗體、兔抗collagenⅠ單克隆抗體、兔抗MMP-2單克隆抗體，兔抗TIMP-1單克隆抗體、兔抗Smad2單克隆抗體、兔抗Smad3單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體、β-actin單克隆抗體(美國Epitmics公司)；BCA試劑盒、RT-PCR試劑盒、TRIzol試劑盒(美國Tocris公司)；TUG1 siRNA和陰性對照siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；α-SMA、TUG1、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3和GAPDH引物(英濰捷基公司，引物序列見表1)。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2方法

1.2.1大鼠肝纖維化模型的制備 將75只大鼠分為對照組和肝纖維化組，對照組15只，肝纖維化組60只，肝纖維化組大鼠腹腔注射1%DMN[1 ml/(kg·d)]，每星期連續(xù)用藥3 d，共4周；對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，方法同肝纖維化組大鼠，共4周。建模結(jié)束后，肝纖維化組大鼠存活59只，死亡1只，對照組大鼠無死亡，取肝纖維化組大鼠14只和對照組大鼠肝臟組織進(jìn)行HE染色，測定肝組織中α-SMA、TUG1 mRNA水平。

1.2.2大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染TUG1 siRNA 將剩余的45只肝纖維化模型大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為空白對照組、陰性對照組、siRNA干擾組，15只/組。siRNA干擾組大鼠在建立模型的同時(shí)給予尾靜脈注射100 μg TUG1 siRNA，1次/周，陰性對照組大鼠在建立模型的同時(shí)給予尾靜脈注射陰性對照siRNA，1次/周，空白對照組大鼠建模時(shí)尾靜脈注射等量生理鹽水，1次/周，共4周。4周后空白對照組大鼠無死亡，陰性對照組和siRNA干擾組大鼠各死亡1只。處死各組大鼠取肝臟組織進(jìn)行肝組織TUG1、α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3水平測定。

1.2.3大鼠肝臟HE染色 大鼠的肝臟組織標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋后切成4 μm切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.2.4肝星狀細(xì)胞活化 取對數(shù)生長的肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞(5×105個(gè)/孔)接種于6孔板，加入含5 ng/ml TGF-β1的培養(yǎng)液培養(yǎng)活化肝星狀細(xì)胞，并設(shè)立對照組，對照組加入不含TGF-β1的等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，取部分活化肝星狀細(xì)胞作為活化肝星狀細(xì)胞組，測定活化肝星狀細(xì)胞組和對照組細(xì)胞中α-SMA和TUG1 mRNA水平。

1.2.5活化肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)染TUG1 siRNA 將上述剩余部分的活化的HSC-T6細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組和siRNA干擾組，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，在活化HSC-T6細(xì)胞的同時(shí)，siRNA干擾組細(xì)胞中加入1.25 μl TUG1 siRNA(20 μmol/L)，陰性對照組細(xì)胞加入等量siRNA陰性對照，空白對照組不轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)6 h后移去含siRNA培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于細(xì)胞中TUG1、α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3水平測定。

1.2.6RT-PCR法檢測大鼠肝組織和肝星狀細(xì)胞中α-SMA、TUG1、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA水平 TRIzol試劑盒提取各組大鼠肝臟組織和肝星狀細(xì)胞總RNA，檢測肝臟組織和肝星狀細(xì)胞RNA純度，RT-PCR法測定大鼠肝組織和肝星狀細(xì)胞中α-SMA、TUG1、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA水平。以GAPDH為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。α-SMA、TUG1、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.2.7Western blot法檢測大鼠肝組織和肝星狀細(xì)胞α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 蛋白水平 取各大鼠勻漿肝臟組織和肝星狀細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解30 min提取肝臟組織和肝星狀細(xì)胞總蛋白，BCA法測定肝臟組織和肝星狀細(xì)胞蛋白濃度，Western blot測定肝組織和肝星狀細(xì)胞α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 蛋白水平，β-actin單克隆抗體為內(nèi)參照，目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠肝臟HE染色 對照組大鼠肝臟組織未見明顯異常，肝纖維化組大鼠肝臟組織見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，小葉間匯管區(qū)有大量纖維增生，形成假小葉。見圖1。

圖1 兩組大鼠肝組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of liver tissue of two groups of rats (×200)

2.2兩組大鼠肝組織中α-SMA和TUG1 mRNA水平 與對照組相比，肝纖維化組大鼠肝組織中α-SMA和TUG1 mRNA水平升高(P<0.05，圖2)。

圖2 肺組織中α-SMA和TUG1 mRNA相對表達(dá)水平Fig.2 Relative expressions of α-SMA and TUG1 mRNA levels in liver tissuesNote:**.P<0.01 vs Control group.

2.3兩組肝星狀細(xì)胞中α-SMA和TUG1 mRNA水平 與對照組相比，活化肝星狀細(xì)胞組肝星狀細(xì)胞中α-SMA和TUG1 mRNA水平升高(P<0.05，圖3)。

圖3 活化肝星狀細(xì)胞中α-SMA和TUG1 mRNA相對表達(dá)水平Fig.3 Relative expressions of α-SMA and TUG1 mRNA levels in activated hepatic stellate cellsNote:**.P<0.01 vs Control group.

2.4沉默TUG1對肝纖維化大鼠肝組織TUG1、α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平的影響 與空白對照組和陰性對照組相比，siRNA干擾組大鼠肝組織TUG1、α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA水平均降低(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組大鼠肝組織各指標(biāo)mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 3組大鼠腫組織中 TUG1、α-SMA、collagenⅠ,MMP-2,TIMP-1,Smad2及Smad3 mRNA水平Fig.4 mRNA levels of TUG1,α-SMA,collagenⅠ,MMP-2,TIMP-1,Smad2 and Smad3 of rat liver tissues in three groupsNote:**.P<0.01 vs Blank control group;##.P<0.01 vs Negative control group.

2.5沉默TUG1對肝纖維化大鼠肝組織α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平的影響 與空白對照組和陰性對照組相比，siRNA干擾組大鼠肝組織α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3蛋白水平均降低(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組大鼠肝組織各指標(biāo)蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 3組大鼠肝組織中 TUG1、α-SMA、collagenⅠ,MMP-2,TIMP-1,Smad2及Smad3 mRNA蛋白水平Fig.5 Protein levels of α-SMA,collagenⅠ,MMP-2,TIMP-1,Smad2,and Smad3 mRNA in liver tissues of three groups of ratsNote:1.Blank control group;2.Negative control group;3.mRNA interference group.**.P<0.01 vs Blank control group;##.P<0.01 vs Negative control group.

2.6沉默TUG1對活化肝星狀細(xì)胞中TUG1、α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平影響 與空白對照組和陰性對照組相比，siRNA干擾組活化肝星狀細(xì)胞TUG1、α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 mRNA水平均降低(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組活化肝星狀細(xì)胞各指標(biāo)mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

圖6 3組活化肝星狀細(xì)胞中TUG1、α-SMA、collagenⅠ,MMP-2,TIMP-1,Smad2及Smad3 mRNA水平Fig.6 TUG1,α-SMA,collagenⅠ,MMP-2,TIMP-1,Smad2,Smad3 mRNA levels of activated hepatic stellate cells in three groupsNote:**.P<0.01 vs Blank control group;##.P<0.01 vs Negative control group.

2.7沉默TUG1對活化肝星狀細(xì)胞α-SMA、colla-genⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)水平影響 與空白對照組和陰性對照組相比，siRNA干擾組活化肝星狀細(xì)胞α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3蛋白水平均降低(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組活化肝星狀細(xì)胞各指標(biāo)蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

圖7 3組活化肝星狀細(xì)胞中TUG1、α-SMA、collagenⅠ,MMP-2,TIMP-1,Smad2及Smad3蛋白水平Fig.7 Levels of α-SMA,collagen I,MMP-2,TIMP-1,Smad2,and Smad3 proteins of activated hepatic stellate cells in three groupsNote:1.Blank control group;2.Negative control group;3.mRNA interference group.**.P<0.01 vs Blank control group;##.P<0.01 vs Negative control group.

3 討論

lncRNA長度大于200 nt，可以和miRNA相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能，如lncRNA可作為增強(qiáng)子RNA和前體miRNA結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[5]；可通過調(diào)節(jié)抑癌基因影響抑癌信號通路；為染色質(zhì)修飾復(fù)合物提供支架；充當(dāng)miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)；與相應(yīng)的mRNA剪接前體形成雙鏈RNA，并被剪切酶切割形成小干擾RNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)；和其他lncRNA之間相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)等，在肝纖維化中發(fā)揮重要作用[6，7]。TUG1為lncRNA的一種，具有多種生物學(xué)特性，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，高表達(dá)于多種惡性腫瘤，與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移關(guān)系密切[8-11]；TUG1在組織纖維化中也發(fā)揮重要作用，為肺部纖維化的調(diào)節(jié)因子之一，在心臟纖維化中也具有重要作用[12]。Zhu等[4]研究發(fā)現(xiàn)TUG1和心肌纖維化程度呈正相關(guān)，敲低TUG1可改善缺氧誘導(dǎo)的心肌纖維化。但TUG1在肺纖維化中的表達(dá)尚不明確，本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠肝纖維化組織中及活化的肝星狀細(xì)胞中TUG1水平升高，提示TUG1可能參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵為肝星狀細(xì)胞的活化，肝星狀細(xì)胞的活化也是肝纖維化時(shí)細(xì)胞外機(jī)制的主要來源細(xì)胞，正常情況下，肝星狀細(xì)胞合成一定量的細(xì)胞外基質(zhì)(以膠原Ⅲ和膠原Ⅳ為主)，當(dāng)肝臟受到刺激時(shí)，肝星狀細(xì)胞被激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，表達(dá)α-SMA，合成大量膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)增多，以collagenⅣ為主的基底膜改變?yōu)橐詂ollagenⅠ和collagenⅢ膠原為主的基底膜，并進(jìn)一步激活肝星狀細(xì)胞，啟動肝纖維化，肝星狀細(xì)胞分泌α-SMA為肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志[7，13]；MMP-2在正常肝組織中鮮有表達(dá)，主要由肝星狀細(xì)胞活化產(chǎn)生，在肝纖維化過程中MMP-2水平升高[14]；TIMP-1可以特異性抑制間質(zhì)膠原酶、基質(zhì)降解酶等，在降解細(xì)胞外基質(zhì)主要成分collagenⅠ中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。肝星狀細(xì)胞活化后分泌α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1是肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵步驟[16]。本研究沉默TUG1后，肝纖維化組織及活化肝星狀細(xì)胞中TUG1、α-SMA、collagenⅠ、MMP-2、TIMP-1水平均降低，提示降低TUG1水平可逆轉(zhuǎn)肝星狀細(xì)胞活化，抑制肝纖維化。

活化的肝星狀細(xì)胞受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，TGF-β1是最有效的促肝纖維化的細(xì)胞因子，其可通過多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)，Smad蛋白依賴途徑是最經(jīng)典的途徑，Smad2和Smad3是細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smad信號通路的下游信號蛋白，在TGF-β1/Smad信號通路中發(fā)揮重要作用，可間接反映TGF-β1/Smad信號通路的激活情況，在肝纖維化過程中，TGF-β1/Smad信號通路被激活，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[17-19]。本研究沉默TUG1后，肝纖維化組織及活化肝星狀細(xì)胞中Smad2和Smad3水平下降，提示沉默TUG1可通過抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活在抗肝纖維化中發(fā)揮作用。

綜上所述，肝纖維化時(shí)肝組織中TUG1水平升高，下調(diào)TUG1水平可通過逆轉(zhuǎn)肝星狀細(xì)胞活化抑制肝纖維化，其機(jī)制為沉默TUG1后，抑制了TGF-β1/Smad信號通路的激活，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。TUG1有望成為肝纖維化的治療靶點(diǎn)之一。