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    響應(yīng)面法優(yōu)化填充床反應(yīng)器固定化酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)

    2012-09-17 02:30:38潘向昆王瑛瑤魏翠平劉建學(xué)段章群侯冰冰
    中國(guó)糧油學(xué)報(bào) 2012年12期
    關(guān)鍵詞:底物反應(yīng)時(shí)間脂質(zhì)

    潘向昆 王瑛瑤 魏翠平 欒 霞 劉建學(xué) 段章群 侯冰冰

    (河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1,洛陽(yáng) 471003)

    (國(guó)家糧食局科學(xué)研究院2,北京 100037)

    結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(structured lipids,SLs)是天然油脂改性的一類特殊的脂肪。其通過(guò)一些條件(通常情況下是脂肪酶)來(lái)改變天然脂質(zhì)中脂肪酸的組成和位置,將某些特殊營(yíng)養(yǎng)或者生理功能脂肪酸結(jié)合到特定位置,最大程度發(fā)揮合成脂質(zhì)中各種脂肪酸的功效,因此結(jié)構(gòu)脂質(zhì)又名重構(gòu)脂質(zhì)[1]。廣義上的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)是指經(jīng)過(guò)重構(gòu)天然脂質(zhì)中甘三酯脂肪酸所在位置和組成改變,即天然油脂的改性產(chǎn)品,天然油脂的風(fēng)味和物性改變較少,保持了其在食品應(yīng)用的原來(lái)特性[2]。前人曾根據(jù)定位在甘油骨架脂肪酸將結(jié)構(gòu)脂質(zhì)分為定向結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(SSL)和隨機(jī)結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(SL),定向結(jié)構(gòu)脂質(zhì)主要是指長(zhǎng)鏈脂肪酸位于甘油骨架的Sn-2位,中鏈或短鏈脂肪酸位于Sn-1,3位的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì))[3]。

    三酰甘油骨架上的脂肪酸消化吸收代謝有特定的生理特點(diǎn),機(jī)體內(nèi)的脂肪酶水解Sn-1,3位脂肪酸,以游離脂肪酸的形式被吸收,而Sn-2位脂肪酸則以單甘酯的形式被吸收[4]。以1,3特異性固定化脂肪酶催化中碳鏈脂肪酸辛酸制備的MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì),具有快速消化吸收代謝等特點(diǎn),從而為特定人群快速提供能量,而且代謝后在體內(nèi)蓄積少,中鏈脂肪酸和相同質(zhì)量的長(zhǎng)鏈脂肪酸相比產(chǎn)生的能量較少,因此還具有減肥等功效[5]。

    采用填充床反應(yīng)器固定化酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì),具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少且產(chǎn)物便于回收[6]。固定化酶在結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的制備上不僅具有特異性和專一性,而且增加酶的使用壽命,便于條件的調(diào)控。本試驗(yàn)以菜籽油和辛酸為底物,采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法對(duì)影響固定化脂肪酶在填充床中酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的因素進(jìn)行研究,以期得到最佳制備條件。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    菜籽油:市購(gòu);辛酸、正己烷、異丙醇、乙酸乙酯及丙酮:均為色譜純,Sigma-Aldrich公司;固定化脂肪酶:Novozyme公司;其他試劑均為分析純:北京化工廠。

    Waters Acouity型超高效液相色譜儀(配ELSD檢測(cè)器):美國(guó)Waters公司;R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:BUCHI公司;2005-02型低速離心機(jī):國(guó)華機(jī)械有限公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 固定化酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)

    將水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)到預(yù)增加值后的酶裝入固定床反應(yīng)器,按一定比例稱取底物菜籽油與辛酸混勻置于反應(yīng)器,將底物泵入固定床反應(yīng)器,控制反應(yīng)時(shí)間,制備混合產(chǎn)物。

    1.2.2 MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的純化

    酶催化酸解反應(yīng)是在中碳鏈脂肪酸過(guò)量的條件下進(jìn)行的,得到的產(chǎn)物體系中存在大量的酸,在酶催化酸解反應(yīng)過(guò)程中除了生成不同類型(諸如MMM、MLM、LLM、LLL)的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)以外,還會(huì)產(chǎn)生少量甘一脂、甘二脂等中間副產(chǎn)物。因此需要將產(chǎn)物進(jìn)行純化。

    稱取酶催化酸解產(chǎn)物,按酸解產(chǎn)物/乙醇水溶液1∶3比例加入乙醇水溶液(乙醇水體積比70∶30),劇烈搖勻15 min,3 500 r/min離心20 min,靜置15 min,分離出油相,重復(fù)3次,將最終得到的樣品溶于適量正己烷中,加入2滴酚酞,用0.5 mol/L的KOH乙醇水溶液(乙醇水體積比30∶70)滴定至乙醇水溶液變紅,靜置5 min,分離正己烷,加入無(wú)水硫酸鈉出水后旋蒸得到結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。

    1.2.3 超高效液相色譜分析方法

    樣品制備:稱取1.2.2所得結(jié)構(gòu)脂質(zhì) 100 mg,置于5 mL容量瓶中用丙酮定容。過(guò)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜后取0.2 μL進(jìn)UPLC(超高效液相色譜)分析。

    1.2.4 超高效液相色譜分析條件[7]

    采用 BEH C18 柱(2.1 mm ×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:丙酮/乙腈(體積比65∶35);ELSD溫度:40℃;氮?dú)鈮毫?2.1 MPa。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 單因素試驗(yàn)

    2.1.1 反應(yīng)時(shí)間的影響

    圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶催化酸解制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的影響

    在酶量為10 g(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%),底物物質(zhì)的量比(菜籽油/辛酸)為1∶4,反應(yīng)溫度為60℃條件下,考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶催化酸解反應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出,隨反應(yīng)時(shí)間的增加,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)逐漸升高,反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí),MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量基本不變,反應(yīng)達(dá)到平衡。隨著延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的含量雖然有所增加,但是增幅較緩,考慮到試驗(yàn)成本、時(shí)間成本和MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量增加量等各因素,選擇反應(yīng)時(shí)間為2 h較優(yōu)。

    2.1.2 底物物質(zhì)的量比的影響

    在加酶量為10 g(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%),反應(yīng)溫度為55℃,反應(yīng)時(shí)間為2 h的條件下,考察底物物質(zhì)的量比對(duì)酶催化酸解反應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出,隨著底物物質(zhì)的量比增大,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量逐漸升高,符合反應(yīng)方程動(dòng)力學(xué),反應(yīng)物的增加會(huì)使方程向產(chǎn)物增加的方向進(jìn)行。隨著底物物質(zhì)的量比繼續(xù)增大,酶的催化效率會(huì)受到影響,一方面底物的增多會(huì)導(dǎo)致酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制,另一方面在本試驗(yàn)中過(guò)多的辛酸會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系酸值較低,會(huì)導(dǎo)致酶活的降低甚至失活[8]。綜合考慮酶的使用壽命和后續(xù)對(duì)產(chǎn)物的分離純化,選擇菜籽油辛酸底物物質(zhì)的量比1∶4。

    圖2 底物物質(zhì)的量比對(duì)酶催化酸解制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的影響

    2.1.3 反應(yīng)溫度的影響

    在加酶量為10 g(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%),底物物質(zhì)的量比為1∶4,反應(yīng)時(shí)間為2 h的條件下,考察反應(yīng)溫度對(duì)酶催化酸解反應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出,隨著反應(yīng)溫度的升高,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的含量也隨之增加,在溫度為55℃時(shí)反應(yīng)體系中的MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量達(dá)到平衡,隨著溫度的繼續(xù)升高,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的含量會(huì)有所降低,這也說(shuō)明溫度是影響?;D(zhuǎn)移的主要因素[9]??紤]到連續(xù)試驗(yàn)遇到的酶活降低等問(wèn)題,選擇在酶的溫度耐受性范圍內(nèi),通過(guò)提高反應(yīng)溫度來(lái)保證酶的催化酸解效率,選取反應(yīng)溫度55℃。

    圖3 反應(yīng)溫度對(duì)酶催化酸解制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的影響

    2.1.4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

    在加酶量為10 g,反應(yīng)溫度為55℃,底物物質(zhì)的量比為1∶4,反應(yīng)時(shí)間為2 h,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.50%、1%條件下,考察對(duì)酶催化酸解反應(yīng)制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加值對(duì)MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的含量影響比較復(fù)雜,這是由于酶的催化反應(yīng)是建立在酶特有的空間構(gòu)型,水對(duì)于酶維持活性構(gòu)型至關(guān)重要,但是過(guò)多的含水量一方面使底物與酶的活性位點(diǎn)較難結(jié)合,導(dǎo)致反應(yīng)速率的降低,另一方面會(huì)使反應(yīng)由酯化反應(yīng)向水解反應(yīng)轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致生成目標(biāo)產(chǎn)物的減少[10]。

    圖4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶催化酸解制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的影響

    2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)制備條件

    2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取反應(yīng)時(shí)間、底物物質(zhì)的量比、反應(yīng)溫度、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為試驗(yàn)因素,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量為指標(biāo)。各因素的水平編碼見(jiàn)表1。

    運(yùn)用Design-Expert 7.0.0數(shù)學(xué)軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的中心組合試驗(yàn),分析研究影響填充床固定化酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量主要因素,包括29個(gè)試驗(yàn),其中24個(gè)位析因試驗(yàn)點(diǎn),5個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn),見(jiàn)表2。

    表1 Central composite因素及水平編碼表

    表2 Central composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)及MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量測(cè)量值

    2.2.2 模型的建立及顯著性分析

    根據(jù)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù),以MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量(R1)為響應(yīng)值,利用 Design-Expert 7.0.0 數(shù)學(xué)軟件對(duì)填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)進(jìn)行多元回歸擬合,得到二次多項(xiàng)回歸方程:

    R1=42.10+1.80A+1.30B+3.88C+4.55D+0.84AB+2.21AC - 1.01AD+0.82BC+1.55BD+2.24CD -6.90A2-5.96B2-3.30C2-3.78D2

    由表3可知,填充床酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量回歸模型極顯著(P<0.01)。模型一次項(xiàng)均極顯著,顯著性順序是D(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù))>C(反應(yīng)溫度)>A(保留時(shí)間)>B(底物物質(zhì)的量比);二次項(xiàng)AB,BC交互項(xiàng)為顯著,其余均為極顯著,表明各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是線性關(guān)系。預(yù)測(cè)方程的決定系數(shù)R2=0.992 2,模型的偏離系數(shù)為5.12%,,說(shuō)明方程的擬合度和可信度較高,可以較好地代表反應(yīng)參數(shù)和響應(yīng)值之間的關(guān)系,可以用上述回歸方程對(duì)填充床酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量進(jìn)行分析預(yù)測(cè)和確定最佳生產(chǎn)工藝條件。

    表3 二次多項(xiàng)式回歸模型ANOVA分析

    2.2.3 各影響因素的交互作用分析

    2.2.3.1 反應(yīng)時(shí)間與底物物質(zhì)的量比的交互影響

    圖5顯示了在反應(yīng)溫度為55℃和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%下,反應(yīng)時(shí)間和底物物質(zhì)的量比對(duì)填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在底物物質(zhì)的量比不變的條件下,隨著反應(yīng)時(shí)間的逐漸增加,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),這是由于隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量增大,達(dá)到平衡后,反應(yīng)時(shí)間的增加會(huì)使結(jié)構(gòu)脂質(zhì)出現(xiàn)?;D(zhuǎn)移明顯增大,導(dǎo)致MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的減少。反應(yīng)時(shí)間不變的條件下,隨著底物物質(zhì)的量比的增大,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小現(xiàn)象。

    2.2.3.2 反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度的交互影響

    圖6顯示了在底物物質(zhì)的量比為4∶1和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%下,反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在反應(yīng)時(shí)間不變的條件下,隨著反應(yīng)溫度的逐漸增大,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小,原因在于反應(yīng)溫度的增大,逐漸接近酶的最適溫度使酶活逐漸達(dá)到最大,當(dāng)超過(guò)最適溫度時(shí)酶活受到抑制從而使MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)下降。在反應(yīng)溫度不變的條件下,隨著反應(yīng)時(shí)間的逐漸增加,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

    2.2.3.3 反應(yīng)時(shí)間與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互影響

    圖7顯示了在底物物質(zhì)的量比為4∶1和反應(yīng)溫度為55℃下,反應(yīng)時(shí)間和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在反應(yīng)時(shí)間不變的條件下,隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的逐漸增大,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量隨之增加,達(dá)到最大后出現(xiàn)較小幅度的下降,原因在于水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加使酶活性位點(diǎn)充分暴露從而使催化效率增大,當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大會(huì)使產(chǎn)物發(fā)生水解反應(yīng)。在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變的條件下,隨著反應(yīng)時(shí)間的逐漸增加,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

    2.2.3.4 底物物質(zhì)的量比與反應(yīng)溫度的交互影響

    圖8顯示了在反應(yīng)時(shí)間2 h和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%下,底物物質(zhì)的量比和反應(yīng)溫度對(duì)填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在反應(yīng)溫度不變的條件下,隨著底物物質(zhì)的量比的逐漸增加,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),原因在于隨著底物物質(zhì)的量比的增大,會(huì)使反應(yīng)向著產(chǎn)物增加的方向進(jìn)行,但當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比達(dá)到一定程度時(shí),反應(yīng)體系的pH很低,一方面導(dǎo)致酶活的降低甚至喪失,另一方面也會(huì)使反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生酸解。當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比不變的條件下,隨著反應(yīng)溫度的增加,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),但是減少較小。

    2.2.3.5 底物物質(zhì)的量比與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互影響

    圖9顯示了在反應(yīng)時(shí)間2 h和反應(yīng)溫度為55℃下,底物物質(zhì)的量比和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在所選的范圍內(nèi)存在極值,即存在響應(yīng)面最高點(diǎn)。沿水分含量軸向等高線較沿底物物質(zhì)的量比軸向等高線密集,說(shuō)明水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量影響比底物物質(zhì)的量比顯著。

    2.2.3.6 反應(yīng)溫度與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互影響

    圖10顯示了在反應(yīng)時(shí)間2 h和底物物質(zhì)的量比為4∶1時(shí),反應(yīng)溫度和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。反應(yīng)溫度和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量影響都較顯著,當(dāng)反應(yīng)溫度較低時(shí),水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加對(duì)MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量影響較為明顯,出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)溫度達(dá)到一定程度時(shí),隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量減小的趨勢(shì)減緩。綜合圖5~圖10可知,4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的影響均不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,且影響都極顯著。水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的最主要因素,其次是反應(yīng)溫度,底物物質(zhì)的量比對(duì)其影響最小。

    2.2.4 制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)最佳條件的確定及驗(yàn)證

    通過(guò)Design-Expert 7.0.0數(shù)學(xué)軟件得出最佳制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)條件:保留時(shí)間為2.12 h,底物物質(zhì)的量比為4.32,反應(yīng)溫度為60.14℃,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%?;貧w方程預(yù)測(cè)MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)摩爾分?jǐn)?shù)為46.66%。

    在實(shí)際的操作過(guò)程中,填充床固定化酶制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工藝條件為:保留時(shí)間為2 h,底物物質(zhì)的量比為4.5,反應(yīng)溫度為60℃,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%。得到 MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)摩爾分?jǐn)?shù)為46.12%,與理論預(yù)測(cè)值基本一致,相對(duì)誤差為1.16%。說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況擬合很好,驗(yàn)證了所建立模型的正確性,該工藝參數(shù)具有實(shí)用價(jià)值。

    3 結(jié)論

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò) Design-Expert 7.0.0數(shù)學(xué)軟件分析保留時(shí)間、底物物質(zhì)的量比、反應(yīng)溫度和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素對(duì)制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的影響,優(yōu)化確定填充床固定化酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的最佳工藝條件:保留時(shí)間為2 h,底物物質(zhì)的量比為4.5,反應(yīng)溫度為60℃,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%。在此工藝條件下MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為46.12%,在最佳工藝條件下重復(fù)試驗(yàn)MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為46.66%,與方程模型預(yù)測(cè)一致。

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