響應(yīng)面法優(yōu)化豆粕發(fā)酵產(chǎn)共軛亞油酸條件

趙蓉蓉 桑衛(wèi)國

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)

近年來，一種被譽為“奇異天然營養(yǎng)素”的營養(yǎng)品在國外市場上流行起來，就是共軛亞油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)。它是一系列含有共軛雙鍵，具有位置和幾何異構(gòu)效應(yīng)的亞油酸(LA)異構(gòu)體總稱。最初是在反芻動物的肉和乳制品中發(fā)現(xiàn)的一種不飽和脂肪酸［1］。在自然界中，CLA存在于肉類、家禽、海鮮、奶酪、黃油、牛奶以及植物油等多種食物中，尤以反芻動物的乳制品中含量最豐富［2－3］。CLA以其獨特而多樣的生物活性作用而廣受大家關(guān)注。近些年研究發(fā)現(xiàn)，CLA具有減少脂肪累積和改變脂肪代謝，抑制腫瘤和動脈粥樣硬化的發(fā)生，增強機體免疫功能等功能，但其來源有限而動物不能自行合成［4－5］。CLA的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。化學(xué)合成法主要指亞油酸堿法異構(gòu)化合成CLA，但合成的CLA異構(gòu)體組成復(fù)雜，不利于產(chǎn)品的開發(fā)和利用。生物轉(zhuǎn)化法條件溫和，得到的CLA異構(gòu)體組成單一，與天然食物中的CLA異構(gòu)體組成相似。據(jù)報道，有來自14個屬的250多種細菌能將亞油酸轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸，主要有腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等，以乳桿菌屬的植物乳桿菌研究最多，效果亦最優(yōu)［6－11］。杜波［12］從玉米青貯中分離到一株能將亞油酸轉(zhuǎn)化成CLA的植物乳桿菌(ANCLA01)，在優(yōu)化工藝條件下，每毫升發(fā)酵液中CLA含量達47.03 μg。梁新樂［13］自行分離篩選獲得一株植物乳桿菌HSC235菌株，具有轉(zhuǎn)化生成共軛亞油酸的能力。對HSC235菌株靜息細胞轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的反應(yīng)條件進行了單試驗，獲得較佳反應(yīng)條件參數(shù)，共軛亞油酸產(chǎn)量最高可達1.755 mg/mL。Lee等［9］對CLA微膠囊制備工藝進行了研究，提高了CLA的包含率及穩(wěn)定性，為CLA的生產(chǎn)銷售提供便捷。豆粕經(jīng)過微生物發(fā)酵，不僅常規(guī)營養(yǎng)得到改善，產(chǎn)生大量的菌體蛋白，使蛋白含量增加，而且其中的抗營養(yǎng)因子含量大大降低，微生物產(chǎn)生的各類消化酶類可有效地降解其中的抗營養(yǎng)因子和大分子營養(yǎng)物質(zhì)，并富含多種生物活性因子，是一種優(yōu)質(zhì)的新型蛋白源［14］。目前，國內(nèi)外已有不少研究表明，發(fā)酵豆粕可以適量替代水產(chǎn)動物飼料中的魚粉［15－16］。之前研究者大都集中于以亞油酸為底物，液體發(fā)酵生產(chǎn)CLA，而固態(tài)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的報道甚少。因此，對以豆粕為培養(yǎng)基，植物乳桿菌為出發(fā)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)CLA的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

植物乳桿菌突變株Lactobacillus plantarum Nb1:本實驗室分離保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

蘿卜(品種:超級春白玉)，黃豆芽，食用調(diào)和油(52.5%LA):寧波大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場;豆粕:寧波金光食品有限公司;共軛亞油酸標準品(純度99.0%):sigma公司;其他試劑均為分析純。

培養(yǎng)乳酸菌的蔬菜汁制備:將蘿卜和豆芽打漿后，先用4層紗布過濾;濾液煮沸10 min，再次過濾后，即得澄清透明的蔬菜汁。將 V蘿卜汁:V豆芽汁=1∶5的比例配好，121℃，20 min滅菌，與豆粕等重混合作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3 CLA 分析測定

1.3.1 CLA 標準曲線的制作

準確稱取0.077 5 g共軛亞油酸標準品于50 mL容量瓶中，加正己烷溶解，定容。從中分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 50mL 容量瓶中，定容，配制成不同濃度的CLA溶液，在233 nm下測定各自吸光度。以橫坐標為CLA濃度，縱坐標為吸光度繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 CLA紫外吸收標準曲線

1.3.2 發(fā)酵豆粕中CLA產(chǎn)量的測定

豆粕發(fā)酵后取出65℃ 烘干，粉碎過篩，稱取2 g，加正己烷8 mL，水8 mL，振蕩，靜置10 min，萃取正己烷相轉(zhuǎn)入離心管中，離心(10 000×g，5 min)，加無水硫酸鈉干燥，取正己烷相1 mL，加正己烷6 mL稀釋，混勻，在紫外分光光度計中于233 nm下測定吸光度，空白對照為同條件發(fā)酵(不接種，其余條件相同)下豆粕的正己烷提取液，根據(jù)標準曲線測定 CLA含量。

1.4 單因素試驗

分別以菌種接種量、油脂添加量、發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵時間為變量，確定各個因素的適宜范圍。將新鮮豆粕90℃ 烘干，粉碎。取50 g豆粕裝入自封袋中，加50 mL混合蘿卜與豆芽汁，按單因素試驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，用磷酸鈉溶液調(diào)pH 4.5～7.0，油脂添加量為0～2.4 g，乳桿菌接種量為2%～7%(菌液濃度為1.5×105cfu/mL)，混勻，在不同溫度和不同時間下進行發(fā)酵。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

運用 Design－Expert 8.0.5軟件，根據(jù) Box－Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用3因素3水平的三元二次響應(yīng)面分析方法，優(yōu)化豆粕發(fā)酵條件。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel對數(shù)據(jù)進行處理，試驗結(jié)果計算標準差。采用Design－Expert 8.0.5軟件對響應(yīng)面結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同菌種接種量對CLA產(chǎn)量的影響

菌種接種量對CLA產(chǎn)量的影響見圖2。由圖2可知，隨著菌種接種量的上升，CLA產(chǎn)量逐漸增大，在接種量為3%時達到最大，之后隨著接種量的增大CLA產(chǎn)量降低。研究表明，CLA是微生物對LA進行生物氫化作用的中間產(chǎn)物，加大接種量可增加初始酶量，對產(chǎn)量提高有利，但是生物氫化作用是一個需要能量的過程，而培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)是一定的，菌種量的增加勢必會在一定程度上影響菌株的正常生長，進而影響了生物氫化酶的合成，致使CLA的產(chǎn)量下降［17－18］。

圖2 不同菌種接種量對CLA產(chǎn)量的影響(n=9)

2.1.2 不同油脂添加量對CLA產(chǎn)量的影響

油脂添加量對CLA產(chǎn)量的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)油脂添加量極少時，CLA產(chǎn)量較低。CLA產(chǎn)量隨著油脂添加量的增大而增大。在油脂添加量為2 g·(50 g豆粕)－1時CLA產(chǎn)量達到最大，之后隨之降低。研究表明，發(fā)酵底物中亞油酸濃度過高會抑制乳酸菌株的生長，使其亞油酸異構(gòu)酶的活性下降。亞油酸異構(gòu)酶不足時難以將亞油酸完全轉(zhuǎn)化為CLA，進而使CLA的產(chǎn)量下降［19］。另外，植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化CLA時存在明顯的底物抑制現(xiàn)象，過高亞油酸濃度會抑制亞油酸異構(gòu)酶活性［20］。梁新樂［13］研究表明，當(dāng)亞油酸濃度小于0.08% 時，CLA產(chǎn)量隨亞油酸加入量的增大而增大，亞油酸濃度大于0.08%時，隨亞油酸濃度的增大，目的產(chǎn)物共軛亞油酸的產(chǎn)量反而會隨亞油酸濃度增大而減少，與本試驗研究結(jié)果相似。

圖3 油脂不同添加量對CLA產(chǎn)量的影響(n=9)

2.1.3 不同發(fā)酵溫度對CLA產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度對CLA產(chǎn)量的影響見圖4。由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度從29℃ 升高到37℃時，CLA產(chǎn)量逐漸增大，在37℃達到最大。溫度繼續(xù)上升時，CLA產(chǎn)量不再上升，而是呈現(xiàn)下降趨勢。微生物生長與溫度有著密切關(guān)系，低于或高于適合微生物生長的溫度都會影響微生物的生長，因此也會影響微生物的一些生理活動，比如產(chǎn)酶。酶的活性也需要在一定溫度的下有效，溫度過高或過低也會影響酶的活性，進而影響酶催化反應(yīng)的進行。王武等［21］對嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)進行研究，結(jié)果表明隨著溫度升高，亞油酸異構(gòu)酶的穩(wěn)定性降低，當(dāng)反應(yīng)溫度超過40℃時，酶活力不斷減小，直到變性。因此，亞油酸異構(gòu)酶在適宜的溫度下能夠較有效地催化LA轉(zhuǎn)變成CLA。

圖4 不同發(fā)酵溫度對CLA產(chǎn)量的影響(n=9)

2.1.4 不同培養(yǎng)基初始pH對CLA產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基初始pH對CLA產(chǎn)量的影響見圖5。由圖5可知，隨著pH的上升，CLA產(chǎn)量大幅上升，在初始pH 6.0時達到最大。培養(yǎng)基pH的不同會影響菌株的生長，同時pH還會影響酶的結(jié)構(gòu)以致改變酶的活性。亞油酸異構(gòu)酶在pH 2.0～8.8均具有活性，但僅在pH 5.5～8.5范圍時才具有轉(zhuǎn)化合成CLA的能力［22］。試驗所選用的植物乳桿菌的最適pH為6.0，在pH 6.0時植物乳桿菌細胞增殖較快。苗士達等［23］對亞油酸異構(gòu)酶性質(zhì)研究結(jié)果表明，在pH 6.0時，亞油酸異構(gòu)酶活性較高，植物乳桿菌轉(zhuǎn)化亞油酸生成CLA量較大。于國萍等［24］對德式乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶酶學(xué)性質(zhì)進行研究，結(jié)果表明當(dāng)pH 6.0時，酶活力達到最高，在pH大于6.0的條件下酶活力迅速下降。本試驗最適初始pH 6.0，與前人研究結(jié)果一致。

圖5 不同培養(yǎng)基初始pH對CLA產(chǎn)量的影響(n=9)

2.1.5 不同發(fā)酵時間對CLA產(chǎn)量的影響

CLA產(chǎn)量隨發(fā)酵時間變化如圖6所示。接種培養(yǎng)后，每隔12 h取樣一次，測定CLA產(chǎn)量。在發(fā)酵12 h后即有CLA檢測到，之后隨著發(fā)酵時間的延長，CLA產(chǎn)量逐漸上升，在84 h時CLA產(chǎn)量達到最大。然后隨著時間的增加，發(fā)酵豆粕培養(yǎng)基中CLA產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢。研究表明，發(fā)酵時間過短，微生物產(chǎn)酶性能得不到充分發(fā)揮，發(fā)酵時間過長會導(dǎo)致細胞衰亡和培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)缺失，CLA的生物合成是一個動態(tài)的過程，生成的CLA是乳酸菌對LA進行生物氫化作用的中間產(chǎn)物，隨著反應(yīng)的不斷進行，CLA會被繼續(xù)加氫轉(zhuǎn)化為油酸或硬脂酸［25］。因此，在一定的時期終止發(fā)酵更有利于CLA的積累。本試驗中，最適發(fā)酵溫度為84 h。

圖6 不同發(fā)酵時間對CLA產(chǎn)量的影響(n=9)

2.2 響應(yīng)面分析試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box－Behnken中心設(shè)計原理，對影響CLA產(chǎn)量的3個重要因素即菌種接種量、油脂添加量、發(fā)酵時間，采用響應(yīng)面分析軟件設(shè)計了3因素3水平中心組合設(shè)計，對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)CLA的最佳發(fā)酵條件進行優(yōu)化。其余條件為培養(yǎng)基初始pH 6.0，發(fā)酵溫度37℃。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平表見表1，Box－Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平表

表2 Box－Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

將試驗結(jié)果利用軟件Expert－design 8.0.5分析處理，得到回歸方程如下:

對以上回歸模型各項進行方差分析、F檢驗，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析

由表3可知，模型的P值＜0.000 1，表明該試驗?zāi)Ｐ头浅ｏ@著。擬合項P值=0.386 6＞0.05，說明方程對試驗的擬合度良好，此方法可靠。在各模型參數(shù)中，X1、X2、X3、X2X3、X12、X22、X32對CLA產(chǎn)量影響極其顯著(P ＜ 0.01)，而 X1X2、X1X3對 CLA 產(chǎn)量影響不顯著。

圖7 接種量和油脂添加量交互作用的響應(yīng)面及等高線

根據(jù)回歸分析結(jié)果做響應(yīng)面圖及其等高線圖，見圖7～圖9所示。圖7～圖9顯示了菌種接種量、油脂添加量、發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕中CLA產(chǎn)量的影響及其他們之間的相互作用。由圖7～圖9可知，3個因素(X1、X2、X3)對發(fā)酵豆粕中CLA產(chǎn)量的響應(yīng)值(Y)存在極值點。

根據(jù)軟件的響應(yīng)面法分析得到一組植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)CLA的優(yōu)化結(jié)果:接種量3.18%，油脂添加量 1.93 g·(50 g 豆粕)－1，發(fā)酵時間 80.77 h，最大 CLA 產(chǎn)量為 702.11 μg/g。

為了實際應(yīng)用的方便性，確定適宜的發(fā)酵條件為:接種量3.2%，油脂添加量為 1.93 g·(50 g豆粕)－1，發(fā)酵時間80 h，在以上條件下進行多次重復(fù)試驗，得到發(fā)酵豆粕中的平均CLA產(chǎn)量為700.32 μg/g，這與計算的數(shù)據(jù)較吻合，可見該模型能準確的預(yù)見實際產(chǎn)量。在上述條件下，所得CLA對食用油的轉(zhuǎn)化率為3.08%。

3 結(jié)論

以植物乳桿菌為出發(fā)菌株，豆粕為培養(yǎng)基，對固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)CLA進行了研究。單因素試驗考查了不同菌種接種量、油脂添加量、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵時間對CLA產(chǎn)量的影響。確定各自的最優(yōu)值為:菌種接種量3.0%，油脂添加量2.0 g·(50 g豆粕)－1，初始 pH 6.0，發(fā)酵溫度 37 ℃，發(fā)酵時間84 h。

選取接種量、油脂添加量、發(fā)酵時間作為Box－Behnken試驗設(shè)計的變量，進行響應(yīng)面分析，結(jié)果表明，3個因素對CLA產(chǎn)量的影響都極顯著，油脂添加量和發(fā)酵時間之間的交互作用也極顯著，接種量和油脂添加量以及接種量和發(fā)酵時間之間的交互作用不顯著。得到優(yōu)化條件為:接種量3.2%，油脂添加量 1.93 g·(50 g 豆粕)－1，發(fā)酵時間 80 h。經(jīng)重復(fù)試驗，得到發(fā)酵豆粕中的平均CLA產(chǎn)量為700.32 μg/g，CLA對食用油的轉(zhuǎn)化率為3.08%。實際結(jié)果與預(yù)測值較吻合。

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