CD40L在阿爾茨海默病中的免疫調(diào)節(jié)作用☆

王寶萍 李東風(fēng) 胡方方 徐書雯

目前阿爾茨海默病 （Alzheimer's Disease，AD）病因尚不清楚，可能與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。尸檢發(fā)現(xiàn)AD患者海馬及腦葉區(qū)存在炎性老年斑，說明β 淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）誘發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與AD的發(fā)生發(fā)展。近來國外研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子受體超家族成員CD40與其同源配體CD40L相互作用使Aβ1-42纖維體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨?、炎性反應(yīng)擴(kuò)大、加重對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷［1］，國內(nèi)對(duì)CD40-CD40L信號(hào)介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)與AD的關(guān)系方面研究甚少。目前認(rèn)為Aβ1-42寡聚體對(duì)神經(jīng)元的毒性作用最強(qiáng)，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面是否也是最強(qiáng)尚不清楚，本文通過體外建立AD的炎性反應(yīng)模型，探討CD40-CD40L信號(hào)在AD炎癥反應(yīng)中的作用，尋找治療AD的可能的靶點(diǎn)，為后續(xù)試驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.1.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 新生乳鼠（3 d內(nèi)）購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 （許可證號(hào)：SCXK（粵）2009－0011）無菌條件下取出大腦皮質(zhì)，放入預(yù)冷、D-Hanks液清洗2次，小心剝離腦膜和血管，0.125%的胰酶消化，終止后過濾，離心，計(jì)數(shù)，接種（DMEM/F12高糖培養(yǎng)基，含1%青霉素、鏈霉素，20%胎牛血清）。24 h后全量換液、之后3 d換液一次，至7～9 d膠質(zhì)細(xì)胞分層。上層細(xì)胞為圓形或橢圓，主要是小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，下層細(xì)胞連成片主要是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。輕輕搖晃培養(yǎng)瓶5 min，收集上層細(xì)胞，差速貼壁法進(jìn)一步純化小膠質(zhì)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD11b。

1.1.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 取材接種同前，不同的是第2天更換無血清神經(jīng)元培養(yǎng)基（含1%青霉素、鏈霉素，含 2%B27），3 d一次換液，4～5 d左右形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。

1.2 Aβ1-42寡聚體制作 將人工合成的 Aβ1-42晶體 0.5 mg從－20℃冰箱中取出，六氟異丙醇（HFIP）0.11 mL溶解、重懸。室溫在通風(fēng)櫥內(nèi)使HFIP揮發(fā)，Aβ1-42形成白色肽膜。然后用20 μL二甲基亞楓DMSO溶解，稀釋分裝。4℃、24 h后即為 Aβ1-42 寡聚體［2］，透射電鏡鑒定。

1.3 小膠質(zhì)細(xì)胞炎性模型建立

將分離純化的小膠質(zhì)細(xì)胞以1×105/孔分別接種到六孔板中，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組：采用不同濃度的寡聚體干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（未給出），本實(shí)驗(yàn)采取濃度為 2.5 μg/mL 的 Aβ1-42 寡聚體單獨(dú)及聯(lián)合 2 μg/mL CD40L干預(yù)組、T細(xì)胞參與的適應(yīng)性免疫應(yīng)答產(chǎn)物之一γ干擾素（IFN-γ）10 μg/mL聯(lián)合Aβ1-42組，并設(shè)立對(duì)照，包括單獨(dú)予CD40L干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞及空白對(duì)照組，培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后檢測小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放水平及向抗原提呈功能轉(zhuǎn)化情況；將干預(yù)過的小膠質(zhì)細(xì)胞上清液繼續(xù)培養(yǎng)神經(jīng)元同時(shí)將不同干預(yù)條件直接培養(yǎng)神經(jīng)元，分別培養(yǎng)24 h檢測神經(jīng)元乳酸脫氫酶（LDH）的釋放水平來觀察神經(jīng)元的損傷，隨后用 2.5 μg/mL抗 CD40抗體阻斷CD40-CD40L通路后，繼續(xù)觀察以上指標(biāo)的變化。

通過ELLSA法檢測細(xì)胞上清液炎性介質(zhì)TNF-α的釋放，嚴(yán)格按ELLSA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD40及MHCⅡ表達(dá)：收集細(xì)胞，PBS洗2次（1000 r/min，5 min），100 μLPBS 懸浮細(xì)胞，分別加入抗小 鼠FITC-CD40 抗體 （0.5 mg/mL）5 μL 或抗小鼠 FITCCD45 抗體（0.5 mg/mL）5 μL，抗小鼠 PE-MHCⅡ抗體（0.2 mg/mL）5 μL，避光室溫孵育30 min，PBS 洗2 次（1 000 r/min，5 min），400 μL PBS 懸浮細(xì)胞，上機(jī)即流式細(xì)胞儀檢測。

小膠質(zhì)細(xì)胞被干預(yù)后的炎性上清液進(jìn)一步干預(yù)神經(jīng)元后，用ELLSA法檢測神經(jīng)元上清液LDH的釋放情況，嚴(yán)格按LDH試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 研究資料均采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 小膠質(zhì)細(xì)胞胞體圓形或橢圓形；流式細(xì)胞術(shù)鑒定純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞，表面CD11b的陽性率在95%以上（見圖1）。

圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD11b流式鑒定

2.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定 培養(yǎng)4～5 d后，神經(jīng)元開始形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見細(xì)胞為棕褐色，陽性率為90%以上（見圖2）。

圖2 神經(jīng)元免疫細(xì)胞化學(xué)染色

2.3 Aβ1-42寡聚體的制作 制作成功的 Aβ42寡聚體在透射電鏡下顯示為圓形或橢圓形的立體結(jié)構(gòu)（見圖 3）。

圖3 Aβ1-42寡聚體透射電鏡下檢測

2.4 CD40L對(duì)AD炎癥細(xì)胞模型影響及神經(jīng)元損傷情況 與對(duì)照組相比，Aβ1-42寡聚體為2.5 μg/mL干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞24 h時(shí)，發(fā)現(xiàn)上清液中TNF-α釋放明顯增加，加入CD40L或IFN-γ后炎性介質(zhì)增加更明顯，加入抗CD40抗體后，發(fā)現(xiàn)上清TNF-α 釋放減少，與 Aβ1-42＋CD40L 組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性上清液培養(yǎng)神經(jīng)元后，Aβ1-42＋CD40L組與Aβ1-42組相比 LDH 的釋放增加，Aβ1-42＋CD40L＋抗 CD40抗體組較Aβ1-42＋CD40L組減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Aβ1-42等直接培養(yǎng)神經(jīng)元，與炎癥上清液培養(yǎng)神經(jīng)元比較，LDH釋放明顯少 （見表1）。加入CD40L后小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD40及MHCⅡ分子共表達(dá)陽性率比單獨(dú)Aβ1-42干預(yù)組高（見圖4）；加入抗CD40抗體后，二者的共表達(dá)陽性率較Aβ1-42單獨(dú)及聯(lián)合CD40L干預(yù)組下降（見圖4）。

圖4 小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD40及MHCⅡ表達(dá)

3 討論

CD40L是主要表達(dá)于活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞及血小板，而CD40表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等。CD40L在一定條件下可與CD40相結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。AD患者血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）受到破壞，血液中活化的 CD4＋T細(xì)胞可以透過BBB進(jìn)入腦組織參與免疫反應(yīng)。

為研究CD40L在Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及對(duì)神經(jīng)元的影響，我們在體外建立AD炎癥反應(yīng)模型，并用炎癥上清液培養(yǎng)神經(jīng)元，模擬AD患者體內(nèi)炎性微環(huán)境的改變對(duì)神經(jīng)元的影響。結(jié)果表明：Aβ1-42寡聚體聯(lián)合CD40L較單獨(dú)干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞更能促進(jìn)TNF-α釋放。提示在促炎方面CD40L與Aβ1-42具有協(xié)同作用。我們繼續(xù)用抗CD40抗體通過阻斷CD40-CD40L通路，可以減輕Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)元的損傷。研究發(fā)現(xiàn)在TgAPPsw/CD40L基因缺陷鼠及體外阻斷CD40-CD40L通路可以降低Aβ1-42 纖維體誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)［3－4］。這與我們的研究基本一致。此外，CD40L還可以促進(jìn)Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)CD40及MHCII分子明顯增加，促進(jìn)其向抗原提呈功能的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而加重對(duì)神經(jīng)元的損傷。為進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論，我們通過用T細(xì)胞的炎癥產(chǎn)物IFN-γ干預(yù)Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其與CD40L聯(lián)合Aβ1-42產(chǎn)生的致炎效應(yīng)相當(dāng)。有研究［5］用米諾環(huán)素下調(diào)T細(xì)胞活化產(chǎn)生的CD40L，可以減少細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)產(chǎn)生Aβ1-42的神經(jīng)元的損傷。說明CD40及CD40L對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面均具有重要作用。此外，Aβ1-42及CD40L直接或炎癥上清液干預(yù)神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)后者對(duì)神經(jīng)元的損傷更重。阻斷CD40-CD40L信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元損傷減輕。CD40L可能通過腫瘤壞子因子受體相關(guān)因子 （tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF）進(jìn)一步活化核因子 κB（NF-κB）信號(hào)通路［6］或通過轉(zhuǎn)錄因子活化金屬蛋白激酶［7］發(fā)揮作用。

表1 不同干預(yù)組小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α水平、直接培養(yǎng)神經(jīng)元及炎性上清液培養(yǎng)神經(jīng)元后LDH的釋放水平

Aβ1-42可以誘導(dǎo)CD40-CD40L調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的固有免疫及適應(yīng)性免疫活化［8］，加重神經(jīng)元損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞表面有不同的受體，在不同的微環(huán)境條件下，Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)毒性作用，而CD40L則是促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性的重要介質(zhì)，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞向抗原提呈功能轉(zhuǎn)化及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，進(jìn)一步損傷神經(jīng)元，因此，早期阻斷CD40-CD40L通路有望成為治療AD的潛在靶點(diǎn)。

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