西紅花酸體內(nèi)外抗氧化作用的研究

石 磊

（安徽省金寨縣中醫(yī)院藥劑科，安徽 六安 237300）

氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧（ROS）產(chǎn)生增加或清除減少，從而導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原自穩(wěn)態(tài)失衡，ROS在體內(nèi)大量蓄積而引起機(jī)體氧化損傷的過(guò)程。現(xiàn)代研究表明，ROS參與多種疾病的形成與發(fā)展，其中它所介導(dǎo)的低密度脂蛋白（LDL）氧化修飾是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)的提出為應(yīng)用抗氧化劑防治AS提供了理論依據(jù)。番紅花為鳶尾科植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭，在歐洲許多國(guó)家被廣泛用作調(diào)味品和食品著色劑，有“香料之王”之美譽(yù)。現(xiàn)代研究表明，番紅花具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。西紅花酸為番紅花中主要活性成分之一，具有明顯的抗AS作用[2]，本研究主要從體內(nèi)外兩方面探討西紅花酸的抗氧化作用，以期闡明其抗AS作用機(jī)制，為臨床使用西紅花酸防治AS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220g，由南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供；西紅花酸，由本實(shí)驗(yàn)室制備（含量＞80%）；總抗氧化能力（TAC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）、丙二醛（MDA）及抗超氧陰離子（O2-）測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；其他試劑均為分析純。752紫外分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 超氧陰離子（O2-）清除能力測(cè)定利用次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生O2-，觀察西紅花酸對(duì)的清除作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、維生素C組及西紅花酸組（5、10、20μmol/L）。實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 LDL氧化易感性測(cè)定

取健康人靜脈血，EDTA抗凝，分離血漿，超速離心法分離LDL，并于4℃在10 mmol/L PBS（pH 7.4）中透析24h，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定LDL中蛋白含量，并調(diào)整濃度至1mg/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)Control組、Model組（LDL＋Cu2+）、西紅花酸組（LDL＋Cu2+＋西紅花酸），每組6個(gè)樣本。于96孔培養(yǎng)板中分別加入LDL和PBS（終反應(yīng)體積0.2mL，LDL終濃度為100μg/mL），混勻。西紅花酸組加入不同濃度西紅花酸溶液（終濃度分別為5、10、20μmol/L），Control組和Model組均加入等量PBS，混勻，37℃孵育1h。除Control組加入PBS外，其余各組均加入CuSO4溶液（終濃度5μmol/L），37℃孵育3h，每10 min測(cè)定一次234 nm處吸光度（A234），參照文獻(xiàn)方法[3]計(jì)算LDL氧化延遲時(shí)間（Lag time）和達(dá)最大氧化速率時(shí)間（Tmax）。將上述反應(yīng)體系繼續(xù)孵育至12h，加入EDTA-Na2終止反應(yīng)，TBA比色法測(cè)定反應(yīng)液中MDA含量。

1.2.3 大鼠血清抗氧化能力測(cè)定

Wistar大鼠18只，隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組和西紅花酸組（50mg/kg及25mg/kg），每組6只，自由進(jìn)食、飲水。西紅花酸組每天灌胃給予相應(yīng)濃度西紅花酸，對(duì)照組給予等容量生理鹽水，連續(xù)7d。末次給藥后2h，眼眶取血，分離血清。血清TAC采用Fe3+還原法測(cè)定，血清SOD、GPX活性分別采用黃嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）比色法測(cè)定，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。另取血清0.2mL，加入50μmol/L CuSO4溶液0.2mL，混勻后于37℃孵育5 h，TBA比色法測(cè)定MDA含量。

表1 Inhibitory effect of crocetin on LDL oxidation induced by cupric ions （χ— ±s，n=6）

表2 Effect of crocetin on the susceptibility of rat serum to in vitro oxidation （χ— ±s，n=6）

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 西紅花酸對(duì)O2-的清除作用

西紅花酸呈濃度依賴性地減少次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生的，5、10和20μmol/L西紅花酸對(duì)的清除率分別為23.59±5.49%、36.50±4.36%和53.40±7.62%。見(jiàn)圖1。

圖1 Scavenging effect of crocetin on superoxide anion （）generated by hypoxanthine/xanthine oxidase system （χ— ±s，n=6）..*P ＜0.01 versus Control.

2.2 西紅花酸對(duì)LDL氧化易感性的影響

Lag time和Tmax是衡量LDL氧化易感性的兩個(gè)重要指標(biāo)。由表1可見(jiàn)，西紅花酸能顯著增加LDL氧化的Lag time和Tmax，這一結(jié)果與其減少銅離子誘導(dǎo)的MDA生成作用相一致，提示西紅花酸能明顯提高LDL抗氧化能力。

2.3 西紅花酸對(duì)大鼠血清抗氧化能力的影響

由表2可見(jiàn)，大鼠在給予西紅花酸7 d后，血清TAC及SOD、GPX活性均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。正常情況下，大鼠血清MDA含量較低，補(bǔ)充西紅花酸50 mg/kg和25 mg/kg雖有降低血清MDA趨勢(shì)，但各組間并無(wú)明顯差異（data not shown）；在加入銅離子氧化5 h后，對(duì)照組血清MDA含量顯著增加，而在補(bǔ)充西紅花酸的大鼠，其血清MDA含量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），提示西紅花酸能顯著提高大鼠血清抗氧化能力。

3 討 論

ROS是生物體在需氧代謝或巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)中產(chǎn)生的活性基團(tuán)或分子，具有高度氧化活性，極易攻擊生物膜中脂質(zhì)及核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，引起機(jī)體氧化損傷。現(xiàn)代研究表明，ROS參與多種疾病的病理進(jìn)程，其中ROS介導(dǎo)的LDL氧化修飾，是AS形成與發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。臨床資料顯示，AS患者血清及LDL抗氧化能力較正常人顯著降低，血漿Ox-LDL水平明顯升高且與AS病變程度密切相關(guān)[4,5]?？寡趸瘎┤缇S生素E、維生素C及β-胡蘿卜素等的攝入量與AS性心血管病發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，補(bǔ)充多酚類、類胡蘿卜素類等天然抗氧化劑能明顯提高機(jī)體及LDL抗氧化能力，降低心血管疾病死亡率[6,7]。這些結(jié)果提示，補(bǔ)充抗氧化劑、增強(qiáng)機(jī)體及LDL抗氧化能力可能是防治AS及其相關(guān)性心腦血管疾病有效途徑之一。

西紅花酸為天然類胡蘿卜素類化合物，能明顯抑制AS形成與發(fā)展，但對(duì)其抗AS作用機(jī)制至今仍未完全闡明。本研究顯示，西紅花酸能有效清除次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生的O2-，降低LDL氧化易感性，顯示了良好的體外抗氧化活性。藥動(dòng)學(xué)研究表明，大鼠灌胃給予西紅花酸50mg/kg，40 min后血藥濃度即達(dá)峰值，10μmol/L以上血藥濃度可維持100min以上[8]，這一濃度與本研究所用濃度接近，提示西紅花酸在體內(nèi)也能達(dá)到有效血藥濃度，發(fā)揮清除ROS、抑制LDL氧化等作用。為了證實(shí)上述推測(cè)，本研究觀察了西紅花酸對(duì)大鼠抗氧化能力的影響。結(jié)果顯示，西紅花酸能明顯提高大鼠血清TAC，后者是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。由于血清中脂質(zhì)過(guò)氧化物主要存在于LDL等脂蛋白中，血清抗氧化能力與LDL氧化易感性密切相關(guān)，因此檢測(cè)血清抗氧化能力可間接反映LDL氧化易感性。在本研究中，雖然補(bǔ)充西紅花酸對(duì)大鼠血清脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量無(wú)明顯影響，但卻能顯著增強(qiáng)血清抵抗銅離子誘導(dǎo)的氧化作用，提示西紅花酸能有效提高血清抗氧化能力、降低LDL氧化易感性，這一作用與西紅花酸提高AS家兔血清及LDL抗氧化能力、降低血清Ox-LDL水平相一致[2]，提示西紅花酸可能通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力、減少LDL氧化修飾而發(fā)揮抗AS作用。

機(jī)體抗氧化防御體系主要包括SOD、GPX等抗氧化酶及維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素等ROS清除劑，提高這些酶的活性或增加抗氧化劑的攝入均可明顯提高血清TAC，降低LDL氧化易感性及血清Ox-LDL水平，從而發(fā)揮抗AS作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，西紅花酸能明顯提高大鼠血清SOD、GPX等抗氧化酶活性，這可能是西紅花酸提高大鼠血清TAC的主要機(jī)制之一。此外，作為脂溶性類胡蘿卜素類化合物，西紅花酸可通過(guò)多種方式對(duì)ROS發(fā)揮直接清除作用。有研究表明，類胡蘿卜素類化合物玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素等可直接摻入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層或LDL等脂蛋白之中，當(dāng)細(xì)胞或LDL等受到ROS攻擊時(shí)，類胡蘿卜素類首先被氧化，從而保護(hù)細(xì)胞或LDL等免受氧化損傷[10]。由于西紅花酸也具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，推測(cè)其也可能摻入細(xì)胞膜或LDL等脂蛋白之中而發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，西紅花酸既能直接清除ROS，又能提高血清SOD、GPX等抗氧化酶活性，從而提高機(jī)體抗氧化能力，降低LDL氧化易感性，這可能是西紅花酸抗AS作用主要機(jī)制之一，至于西紅花酸提高SOD等抗氧化酶活性的確切機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

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