中藥復(fù)方抗癇靈對(duì)戊四氮致癇大鼠腦組織海馬凋亡相關(guān)因子C－fos蛋白表達(dá)的影響

王國(guó)才，楊見民，車琳琳，王小東

(1.黑龍江省衛(wèi)生廳，黑龍江 哈爾濱 150090;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

癲癇與中醫(yī)學(xué)中“癇病”概念是一致的。以突然意識(shí)喪失，發(fā)則仆倒，不省人事，兩目上視，口吐涎沫，四肢抽搐，或口中怪叫，移時(shí)蘇醒，一如常人為主要臨床表現(xiàn)的一種發(fā)作性疾病。又有“癇證”、“癲癇”、“羊癇風(fēng)”之稱?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，癲癇的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，影響因素頗多，迄今為止尚未完全闡明。在正常情況下，C－fos mRNA蛋白在中樞神經(jīng)中有低水平表達(dá)［1－2］。但在機(jī)體受到機(jī)械、化學(xué)、缺血性腦損傷后，C－fos mRNA和 fos蛋白的表達(dá)水平有很大的變化［1－4］，尤其是各種致癇刺激能使C－fos mRNA和fos蛋白的表達(dá)產(chǎn)生明顯的變化，但這種表達(dá)具有刺激特異性、細(xì)胞特異性和時(shí)程特異性［5］。在癲癇發(fā)作時(shí)C－fos則快速一過性高表達(dá)，海馬為主要部位之一。通過檢測(cè)C－fos mRNA蛋白已廣泛用于判別抗癲癇藥物或其他相關(guān)因素在抗癲癇治療中的作用機(jī)制和療效［6］。中醫(yī)學(xué)則對(duì)癇病的認(rèn)識(shí)由來已久，早在戰(zhàn)國(guó)時(shí)代的醫(yī)家就對(duì)癇病有一定的認(rèn)識(shí)，雖然未給癇病以明確的定義，但至少它已經(jīng)認(rèn)識(shí)到癇病是一種腦病，且與先天因素有關(guān)。認(rèn)為癇病系指臟腑受傷，神機(jī)受累，元神失控所致。中醫(yī)歷代醫(yī)家對(duì)癇病的病因病機(jī)觀點(diǎn)不一，近年來多認(rèn)為與痰、氣、風(fēng)、火、瘀血等因，并與情志有關(guān)，是由于正氣不足，臟腑經(jīng)絡(luò)的功能低下所致，即病性屬本虛標(biāo)實(shí)，正氣虧虛為其本［7－8］。故以活血化痰開竅，熄風(fēng)鎮(zhèn)驚安神為法組成中藥復(fù)方抗癇靈，觀察其對(duì)戊四氮致癇大鼠腦組織海馬凋亡調(diào)控因子C－fos等表達(dá)水平的影響，從分子生物學(xué)水平探討中藥復(fù)方抗癇靈治療癲癇的可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試藥物

1 )中藥組方:由穿山甲、龍骨、乳香、沒藥、珍珠、膽南星組成。各藥為末混合。藥材購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)專家門診。

2 )西藥陽(yáng)性對(duì)照藥:丙戊酸鈉緩釋片，由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn);批號(hào):081017;規(guī)格:20mg。研磨后用生理鹽水配制成懸濁液，用時(shí)搖勻，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3 )致癇藥物:戊四氮(pentylenetetrazoze，PTZ):購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，運(yùn)用電子天平精確稱取PTZ粉末，用前1h溶于生理鹽水新鮮配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康的雄性Wistar大鼠共90只(SPF級(jí)，體質(zhì)量為180～220g，在通風(fēng)、濕度、溫度適宜的實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水1周，其中80只用于造模，造模成功后用于下一步實(shí)驗(yàn)，10只用于設(shè)立實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組。

1.3 主要儀器及設(shè)備

X－22臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(德國(guó) LEICAVLTRACUT公司);TA1003電子精密天平(上海天平儀器廠);LKB－NOVA型超薄切片機(jī)(瑞士);OLIMPUS圖像拍攝系統(tǒng)(日本OLIMPUS公司);HPIAS－1000型醫(yī)學(xué)彩色全自動(dòng)圖像分析儀(北京);－70℃低溫冰箱MDF330型(日本 SANYO公司);4℃冰箱(BCD－218A/B型，青島海爾股份有限公司);FBG－1型生物實(shí)驗(yàn)屏蔽柜(成都儀器廠);RNA濃度測(cè)定儀(姜堰市康健醫(yī)療器具公司);電熱恒溫水浴箱(日本HITACHI公司);DU－640型蛋白質(zhì)核酸分析儀(美國(guó)BECKMAN公司);DYY－SB電泳儀(北京醫(yī)療設(shè)備廠);PCR儀PTC－200型(日本MJ公司);紫外可見凝膠檢測(cè)成像系統(tǒng)(北方醫(yī)療設(shè)備廠);SW－CJ－ID型醫(yī)用超凈工作臺(tái)(長(zhǎng)沙光大科學(xué)儀器有限公司);HANNAPH211型酸度計(jì)(上海第三分析儀器廠);ZDX－35型坐式電熱蒸汽壓力鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);實(shí)驗(yàn)室電熱鼓風(fēng)干燥箱(南京實(shí)驗(yàn)儀器廠);DK－SB型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);YDS－10型液氮罐(成都金鳳液氮容器有限公司)。

1.4 主要試劑

免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);二步法免疫組化檢測(cè)試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);多聚賴氨酸(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Roche公司);Sybr熒光定量PCR試劑盒(Roche);TaqDNA聚合酶(大連寶生物有限公司);總RNA提取試劑盒(華舜);10×RNA Buffer(大連寶生物有限公司);瓊脂糖(Amresco公司);PCR引物(上海英駿生物技術(shù)公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)分設(shè)6組。其中由戊四氮所誘導(dǎo)的癲癇大鼠63只隨機(jī)分成5組，設(shè)癲癇模型組(13)、丙戊酸鈉治療組(12)也即西藥對(duì)照組、抗癇靈低劑量治療組(13)，抗癇靈中劑量治療組(13)，抗癇靈高劑量治療組(12)。另設(shè)正常對(duì)照組10只。

2.2 造模方法［9－10］

采用戊四氮(PTZ)腹腔注射(iP)法，每日上午9∶00～11∶30腹腔注射戊四氮(ipPTZ)，注射劑量按亞致痙量35.0mg/kg標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 給藥方法

正常對(duì)照組和癲癇模型組灌服相應(yīng)量生理鹽水，其它各組給予藥物灌胃治療。每日固定時(shí)段灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃治療6周。實(shí)驗(yàn)期間各組均以普通飼料飼養(yǎng)，并自由飲水。

灌服藥物的劑量按正常成人(70kg)與大鼠給藥劑量系數(shù)(0.018)折算。

臨床丙戊酸鈉用量一般為20～30mg/kg，取其25mg/kg的劑量，換算成大鼠灌胃劑量為15.75mg/kg。

中藥抗癇靈低劑量組為0.25g/kg(為正常用量的1/2);中藥抗癇靈中劑量組0.5g/kg(為正常用量);中藥抗癇靈高劑量組1g/kg(為正常用量的1倍)。

2.4 灌注及取材

在冰凍的蠟塊上操作，取腦，修塊，在大腦視交叉與視乳頭之間冠狀切取組織塊，斷面可見白色纖維狀物，即是海馬。用鈍的刀片剝離左右海馬。一部分放入EP管中迅速投入液氮供Real time PCR使用。另一部分置于4%多聚甲醛固定液中，石蠟包埋，供免疫組化使用。

3 觀測(cè)指標(biāo)測(cè)定

3.1 免疫組化方法檢測(cè)大鼠腦組織中海馬C－fos蛋白的表達(dá)

免疫組化采用非生物素二步法免疫檢測(cè)試劑盒。此試劑盒具有簡(jiǎn)單、快速、敏感等特點(diǎn)，因?yàn)橄到y(tǒng)中不再使用生物素，所以避免了由于內(nèi)源性生物素所造成的背景染色。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性目標(biāo)面密度值，取其平均值。按試劑盒說明操作。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR)方法檢測(cè)大鼠海馬組織C－fos mRNA的相對(duì)表達(dá)

PCR技術(shù)是一種體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法，PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。

表1 引物序列及擴(kuò)增子長(zhǎng)度

圖1 各組大鼠海馬組織c－fos增產(chǎn)物凝膠電泳圖

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩比較用q檢驗(yàn)，同組前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 免疫組化方法檢測(cè)各組大鼠腦組織C－fos的表達(dá)

用圖像分析方法。采用 CMIAS系列 Motic.Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性目標(biāo)的面密度值。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)200倍視野，經(jīng)顯微鏡攝像系統(tǒng)輸入計(jì)算機(jī)，選擇免疫組化分析模塊，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腦組織中海馬C－fos蛋白陽(yáng)性目標(biāo)面密度值比較(±s)

表2 各組大鼠腦組織中海馬C－fos蛋白陽(yáng)性目標(biāo)面密度值比較(±s)

注:與空白組比較，※P ＜0.01;與模型組比較，★P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05;與模型組比較，◆P ＞0.05。

組別 n 陽(yáng)性目標(biāo)面密度值空白組 10 0.016 253 ±0.007 551★模型組 10 0.071 570 ±0.018 459※西藥組 12 0.030 957 ±0.004 800▲中藥低劑量組 11 0.048 194 ±0.010 082◆中藥中劑量組 12 0.038 886 ±0.030 121▲中藥高劑量組 12 0.035 819 ±0.019 931▲

由表2所示，模型組大鼠海馬中C－fos mRNA表達(dá)顯著增加，與正常對(duì)照組比具有顯著性差異(P＜0.01);各治療組大鼠治療后海馬中C－fos mRNA表達(dá)，較模型組均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但均未達(dá)到空白組的水平(P＜0.01)。從數(shù)值上看，西藥組治療效果優(yōu)于中藥高、中、低劑量組，但各治療組之間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

4.2 TUNEL法檢測(cè)各組大鼠腦組織海馬的細(xì)胞凋亡與半定量分析 結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠腦組織海馬凋亡細(xì)胞面密度值比較(±s)

表3 各組大鼠腦組織海馬凋亡細(xì)胞面密度值比較(±s)

注:與空白組比較，※P ＜0.01;與模型組比較，★P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05;與模型組比較，◆P ＞0.05。

組別 n 凋亡細(xì)胞面密度值空白組 10 0.002 287 ±0.000 288★模型組 10 0.004 834 ±0.000 657※西藥組 12 0.002 308 ±0.000 407★中藥低劑量組 11 0.004 136 ±0.000 639◆中藥中劑量組 12 0.003 298 ±0.000 987▲中藥高劑量組 12 0.002 797 ±0.000 295★

由表3所示，模型組大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞面密度值顯著高于空白組(P＜0.01)，各治療組大鼠海馬凋亡細(xì)胞面密度值明顯高于空白組，低于模型組，各治療組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。中藥高劑量組和西藥組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中藥中劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);中藥低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)通過戊四氮(PTZ)致癇大鼠模型，運(yùn)用光鏡、免疫組化、TUNEL法、Real time PCR等技術(shù)，對(duì)比觀察了各組大鼠的腦組織海馬病理形態(tài)結(jié)構(gòu)、海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、海馬組織C－fos mRNA的相對(duì)表達(dá)等指標(biāo)的變化，探討活血化痰開竅，熄風(fēng)鎮(zhèn)驚安神法抗癇的可能作用機(jī)制。結(jié)果表明，中藥復(fù)方抗癇靈能有效減少癲癇的發(fā)作頻率，降低其發(fā)作程度。高、中劑量的中藥復(fù)方抗癇靈、西藥丙戊酸鈉均對(duì)癲癇大鼠有良好的治療作用，各組間無顯著性差異，皆能成功控制癲癇大鼠的癇性發(fā)作，對(duì)癲癇大鼠的腦電圖有改善作用。而低劑量組的抗癇靈未能成功控制癲癇大鼠的癲癇發(fā)作，可能與藥物劑量不足有關(guān)。中高劑量的中藥復(fù)方，西藥能顯著降低癲癇大鼠大腦海馬的C－fos表達(dá)，低劑量的中藥復(fù)方降低大腦海馬C－fos表達(dá)不明顯，中藥復(fù)方的抗癇作用機(jī)制可能與降低腦內(nèi)C－fos表達(dá)水平有關(guān)。

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