降濁顆粒對慢性腎衰竭大鼠腎組織纖維連接蛋白的影響

吉 勤 李 瀟 謝江海 楊文榮 谷 艷

1.云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科，云南昆明 650021；2.云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院西醫(yī)診斷教研室，云南昆明 650500

慢性腎功能衰竭（CRF）是各種原發(fā)或繼發(fā)性腎臟病終末期的共同表現(xiàn)，據(jù)國際腎臟病協(xié)會統(tǒng)計(jì)，本癥自然人群發(fā)病率為98～198/百萬人口，我國的統(tǒng)計(jì)資料顯示尿毒癥的年發(fā)病率為100～130/百萬人口[1]，且有逐年增多的趨勢。盡管分子生物學(xué)、免疫學(xué)飛速發(fā)展，對CRF的發(fā)病機(jī)制有了深入的認(rèn)識，但是對于CRF的治療，目前除替代療法和腎臟移植，尚無其他滿意的治療方法。深入開展CRF的防治研究，延緩腎臟病的進(jìn)展，減少CRF的發(fā)生具有重要的現(xiàn)實(shí)和經(jīng)濟(jì)意義。中醫(yī)的辨證論治有著多靶點(diǎn)、綜合治療的效果，探討中醫(yī)藥治療CRF的有效藥方已越來越受到重視。

“降濁顆粒”（由陳皮、茯苓、黨參、半夏、生姜、大黃等組成）針對CRF患者胃腸機(jī)能紊亂這個(gè)環(huán)節(jié)而設(shè)，以健脾和胃、理氣化濕、降濁止嘔為主，經(jīng)過長期臨床驗(yàn)證降濁顆粒能明顯改善CRF患者的胃腸道癥狀[2]，還發(fā)現(xiàn)該藥對降低 CRF 患者血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血磷，升高血鈣也起到了一定的作用。降濁顆粒在改善CRF患者的生存質(zhì)量、延緩CRF進(jìn)程、延緩?fù)肝鰰r(shí)間、使患者帶病延年等方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[3-5]。本研究通過觀察降濁顆粒對CRF大鼠腎組織纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的影響，觀察降濁顆粒對CRF的治療作用及抗腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

BM-IX生物組織包埋機(jī) （孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），臺式干燥箱202-0 型（北京市永光明醫(yī)療器械廠），LEICA RM2235 切片機(jī)，CS-IV攤片烤片機(jī)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar雄性大鼠120只，清潔級 [動物合格證號：SCXK（川）2010-15]，體重（200 ±20） g，6～8 周齡。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

降濁顆粒（15 g/袋；批號：20100501；云南理想藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），洛丁新 （鹽酸貝那普利；10 mg/片；國藥準(zhǔn)字H20030514；批號：008000；北京諾華制藥有限公司），F(xiàn)N小鼠單克隆抗體[Abcam；FN（ab6328）]，超敏 SP（鼠/兔）試劑盒（KIT-9730）（邁新生物技術(shù)公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物模型的制作 選擇健康Wistar雄性大鼠120只，隨機(jī)分為假手術(shù)組及模型組，5/6 腎大部切除法 （兩期手術(shù)）建立CFR大鼠模型。

Ⅰ期手術(shù)：10%水合氯醛0.3 mL/100 g（體重）腹腔麻醉，背左側(cè)12 肋下脊柱旁豎切口，充分剝離左腎包膜，迅速切除上、下1/3 腎組織，以明膠海綿壓迫切面止血，然后分層縫合。術(shù)后10 d行Ⅱ期手術(shù)，同樣的方法麻醉，右側(cè)背部切開暴露右腎，結(jié)扎腎蒂，摘除右腎。假手術(shù)組與模型組同期行2次手術(shù)，但只打開腹腔，剝離腎包膜后縫合腹腔。全部動物自由攝取普通飼料和飲水。

Ⅱ期術(shù)后大鼠喂養(yǎng)7周后，隨機(jī)抽出假手術(shù)組2只、模型組大鼠10只處死，取殘余腎作病理HE染色，觀察腎小球、腎小管、腎間質(zhì)變化，見圖1；所有大鼠尾部采血，測血BUN、Scr；確定CRF模型造模成功。造模期間大鼠死亡18只。

1.4.2 動物分組 模型組大鼠隨機(jī)分為五組：模型對照組、貝那普利組、降濁顆粒高劑量治療組、中劑量治療組、低劑量治療組，每組各15只；加假手術(shù)組（15只）共六組大鼠。

1.4.3 給藥方法 降濁顆粒為臨床經(jīng)驗(yàn)方，60 kg人用劑量為45 g/d。大鼠給藥劑量根據(jù)人與動物體表面積折算公式：理論上大鼠等效量=45 g×0.018 ×5=4.05 g，即理論上大鼠給予降濁顆粒有效劑量為4.05 g/（kg·d），降濁顆粒低劑量組為臨床等效組，降濁顆粒中劑量組給藥劑量為等效劑量的2 倍，即8.1 g/（kg·d），降濁顆粒高劑量組給藥劑量為等效劑量的4 倍，即 16.2 g/（kg·d）。

①假手術(shù)組（正常對照組）：予生理鹽水2 mL/d灌胃；②模型對照組：予生理鹽水2 mL/d灌胃；③貝那普利組：予2 mL/d（1.2 mg/d）貝那普利懸液灌胃；④降濁顆粒低劑量治療組：予降濁顆粒4.0 g/（kg·d）灌胃；⑤降濁顆粒中劑量治療組：予降濁顆粒8.1g/（kg·d）灌胃；⑥降濁顆粒高劑量治療組：予降濁顆粒16.2g/（kg·d）灌胃。 六組動物連續(xù)給藥 60 d，全部動物自由攝取普通飼料和飲水。

1.4.4 檢測內(nèi)容及方法 ①一般狀態(tài)：精神狀態(tài)、攝食、活動、體毛、尿量、體重及生存率；②血清Scr、BUN；③FN免疫組織化學(xué)染色（SP法）技術(shù)分析：采用免疫組化SP法檢測腎小管-間質(zhì)FN，第一抗體采用FN小鼠單克隆抗體，第二抗體采用超敏SP（鼠/兔）試劑盒，DAB顯色。

1.5 結(jié)果判定

陽性：細(xì)胞胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色。按以下分析：①按平均灰度評分：平均灰度灰度數(shù)值從256 到0，256 到0 代表從白到黑。平均灰度數(shù)值越小，表示染色越深，表達(dá)量越多。②按陽性細(xì)胞率評分：按染色陽性細(xì)胞占每個(gè)視野范圍評分：3分：＞相應(yīng)視野50%；2分：占相應(yīng)視野25%～50%；1分：＜相應(yīng)視野25%；0分：無。每張切片低倍鏡下依序單盲觀察5個(gè)視野，計(jì)算各項(xiàng)計(jì)分之和。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模后模型組大鼠與假手術(shù)組比較，進(jìn)食量少，精神差，反應(yīng)遲鈍，活動減少，體重減輕，肢尾濕冷，鼠毛無光澤且有聳毛現(xiàn)象。貝那普利組和降濁顆粒各組經(jīng)過治療后，大鼠進(jìn)食有所恢復(fù)，鼠毛較模型組潤澤、光亮，活動有所增多，體重有所增加。

給藥期間大鼠死亡情況：假手術(shù)組無死亡，貝那普利組死亡1只，模型對照組死亡3只，降濁顆粒低劑量組死亡2只，降濁顆粒中劑量組死亡2只，降濁顆粒高劑量組死亡1只。各組動物死亡率無明顯差異。

2.2 血生化檢查

經(jīng)治療后，貝那普利組、降濁顆粒高、中、低劑量組血清BUN、Scr水平明顯低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），降濁顆粒高、中、低劑量組與貝那普利組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 降濁顆粒對5/6腎切除CRF大鼠BUN、Scr的影響（±s）

表1 降濁顆粒對5/6腎切除CRF大鼠BUN、Scr的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05；與貝那普利組比較，#P＜0.05

組別只數(shù) BUN（mmol/L） Scr（μmol/L）假手術(shù)組模型對照組貝那普利組降濁顆粒高劑量組降濁顆粒中劑量組降濁顆粒低劑量組15 12 14 14 13 13 5.82 ±0.71△#15.67 ±1.02**#10.04 ±1.25**△9.82 ±1.41**△9.98 ±1.52**△10.56 ±1.17**105.40 ±6.97△#137.80 ±9.10**#122.61 ±5.59**△119.35 ±5.87**△124.50 ±5.71**△129.69 ±5.52**△

2.3 降濁顆粒對5/6 腎切除大鼠FN陽性細(xì)胞率及平均灰度的影響

經(jīng)治療后，貝那普利組，降濁顆粒高、中、低劑量組FN陽性細(xì)胞率低于模型對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；降濁顆粒高、中劑量組，貝那普利組FN平均灰度較模型對照組增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。降濁顆粒高、中劑量組FN表達(dá)與貝那普利組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1、圖2。

表1 降濁顆粒對5/6腎切除大鼠FN陽性細(xì)胞率及平均灰度的影響（±s）

表1 降濁顆粒對5/6腎切除大鼠FN陽性細(xì)胞率及平均灰度的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.01；與貝那普利組比較，△P＜0.05

組別只數(shù) FN陽性細(xì)胞率 FN平均灰度假手術(shù)組模型對照組貝那普利組降濁顆粒高劑量組降濁顆粒中劑量組降濁顆粒低劑量組15 12 14 14 13 13 1.20 ±1.35 6.50 ±1.75#△0.86 ±1.03*0.92 ±1.20*1.57 ±2.07*3.50 ±1.71#*△175.73 ±46.03 109.38 ±22.18#△180.55 ±40.13*184.17 ±41.71*184.57 ±46.20*138.50 ±36.24#△

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致的腎臟疾病慢性進(jìn)展，最終導(dǎo)致腎功能衰竭的共同機(jī)制，而細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度積聚是導(dǎo)致腎纖維化的最主要因素之一。研究證實(shí)，ECM合成和降解失衡是ECM聚集及腎小球功能損傷的主要原因[6]。ECM主要是由LN、FN、ColⅢ等成分組成。

FN是細(xì)胞外基質(zhì)中一類重要的糖蛋白，主要位于小管間質(zhì)區(qū)，彼此以纖維結(jié)構(gòu)相連，對腎小管正常結(jié)構(gòu)起著重要作用，正常情況下，F(xiàn)N在腎臟表達(dá)不明顯，在腎間質(zhì)病變時(shí)表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步的研究又發(fā)現(xiàn)其變化與總的細(xì)胞外基質(zhì)的變化趨勢相一致，在炎癥條件下，對介導(dǎo)細(xì)胞增殖和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分的沉積具有重要意義[7]。

在本研究中，模型對照組與假手術(shù)組比較FN表達(dá)增加，符合慢性腎衰竭病理改變。經(jīng)治療后，貝那普利組、降濁顆粒高、中、低劑量組FN陽性細(xì)胞率低于模型對照組，降濁顆粒高、中劑量組和貝那普利組FN平均灰度較模型對照組增高；降濁顆粒高、中劑量組降低FN表達(dá)療效與貝那普利組相當(dāng)。說明降濁顆粒能減少CRF大鼠腎組織FN的表達(dá)，干預(yù)腎間質(zhì)纖維化，延緩大鼠CRF進(jìn)展，尤其以高、中劑量組療效最佳，其療效與貝那普利相當(dāng)。

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