• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    β-細(xì)辛醚通過(guò)PKA/CREB信號(hào)通路對(duì)快速老化癡呆小鼠腦組織凋亡機(jī)制的影響

    2012-09-17 06:33:20費(fèi)洪新李曉明牛英才劉向民周
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞器海馬腦組織

    王 睿 費(fèi)洪新 李曉明 王 偉 劉 韓 牛英才 劉向民周 濤

    1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006

    阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,老年人多發(fā),喪失生活能力,主要是在大腦海馬區(qū)域出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì),即淀粉樣β蛋白 (amyloid β protein,Aβ),Aβ可以使組織產(chǎn)生大量自由基,干擾鈣離子代謝,影響炎癥反應(yīng),從而引起腦神經(jīng)元發(fā)生改變,神經(jīng)元功能也會(huì)發(fā)生改變,引起AD發(fā)生[1-2],癥狀上表現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶障礙是最早出現(xiàn)的,目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)特效藥物進(jìn)行治療。石菖蒲揮發(fā)油是對(duì)機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用有效成分,其中β-細(xì)辛醚是石菖蒲揮發(fā)油的主要成分,β-細(xì)辛醚對(duì)機(jī)體自由基的產(chǎn)生有重要作用,是治療神經(jīng)系統(tǒng)的一種藥物。β-細(xì)辛醚可促進(jìn)氧自由基代謝,影響大腦學(xué)習(xí)和記憶能力。本文筆者通過(guò)將飼養(yǎng)動(dòng)物分組后給予β-細(xì)辛醚探討AD發(fā)病原因,且觀察對(duì)老年癡呆小鼠PKA/CREB信號(hào)通路的影響作用和快速老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響,分析β-細(xì)辛醚藥物作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與儀器 β-細(xì)辛醚購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司,制成0.1 mg/mL混濁液,每天小鼠灌胃量是2 mL;PKA、CREB一抗、SP試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;DydatechMR4000 型酶標(biāo)儀購(gòu)自SantaCruz公司,MPIAS-500 病理圖像分析系統(tǒng)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供,其他均為國(guó)產(chǎn)分析醇試劑。

    1.1.2 動(dòng)物分組 選取健康昆明小鼠10只和快速老化小鼠30只,均為10個(gè)月大小、雄性、體重20~25 g,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。健康昆明小鼠10只作為對(duì)照組,30只快速老化小鼠物隨機(jī)分為模型組(10只)、實(shí)驗(yàn)組(10只)、治療組(10只)。對(duì)照組采用生理鹽水灌胃,2 mL/次;實(shí)驗(yàn)組采用β-細(xì)辛醚混濁液灌胃,2 mL/次;治療組采用腦復(fù)康水溶液5 mg/mL灌胃,2 mL/次;模型組采用生理鹽水灌胃,2 mL/次。所有小鼠均每天灌胃1次,持續(xù)3周。

    1.2 方法

    1.2.1 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃3周后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,連續(xù)5 d,實(shí)驗(yàn)前1 d適應(yīng)性訓(xùn)練,平臺(tái)放在第一象限,其他3個(gè)象限將其放入水中,每天各測(cè)1次,在2 min內(nèi)尚未找到平臺(tái),則將其放平臺(tái)10 s;若120 s之內(nèi)找到平臺(tái),則其在平臺(tái)10 s,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5 d。利用上臺(tái)潛伏期代表實(shí)驗(yàn)小鼠的空間學(xué)習(xí)能力,采用Morrismicrosoft基礎(chǔ)類(lèi)應(yīng)用程序紀(jì)錄逃避潛伏期和游泳距離,兩次潛伏期算術(shù)均值作為這一天成績(jī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,處理結(jié)果。

    1.2.2 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行空間探索試驗(yàn)是任選一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠放入水池中進(jìn)行試驗(yàn),記錄各組實(shí)驗(yàn)小鼠在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)游泳軌跡,考察各組實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)原平臺(tái)記憶,選擇任選一相同入水點(diǎn)將各組實(shí)驗(yàn)小鼠放入水池中,記錄各組實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2 min之內(nèi)游泳路線(xiàn),同時(shí)記錄停留時(shí)間,并對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,處理結(jié)果。

    1.2.3 PKA、CREB的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)小鼠乙醚麻醉,斷頭取出含有海馬組織的腦組織,福爾馬林固定24 h,PBS洗滌,4℃保存12 h,梯度乙醇脫水,透明,浸蠟,石蠟包埋,切片組織厚度6 μm,采用海馬組織分別測(cè)定PKA、CREB,37℃溫箱孵育10 min,PBS洗滌,抗原修復(fù)10 min,正常羊血清37℃溫箱孵育10 min,一抗 (PKA、CREB 為 1 100)37℃溫箱孵育 1 h,PBS 洗滌,二抗 IgG-HRP加入后,37℃溫箱孵育 30 min,PBS洗滌,DAB顯色液顯色,PBS洗滌,蘇木精染色,脫水,透明,封片,測(cè)定部位在海馬區(qū),使用病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定吸光度值,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

    1.2.4 小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)光鏡觀察 實(shí)驗(yàn)小鼠乙醚麻醉,斷頭處死,取出腦組織,沿冠狀切面切下前囟尾側(cè)2.2~4.3 mm的海馬組織,福爾馬林固定,PBS洗滌,4℃保存12 h,梯度乙醇脫水,透明,浸蠟,石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚7 μm,HE染色,光鏡下觀察拍照。

    1.2.5 小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)電鏡觀察 實(shí)驗(yàn)小鼠乙醚麻醉,打胸后心臟灌注固定液,快速取腦,分離海馬,2.5%戊二醛預(yù)固定2 h、四氧化鋨固定,梯度乙醇脫水,透明,浸蠟,石蠟包埋,連續(xù)切片,醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色,電鏡下觀察拍照。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,模型組與對(duì)照組比較,平臺(tái)潛伏期縮短,原平臺(tái)停留時(shí)間縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明模型穩(wěn)定,可以用于實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)組、治療組與模型組比較,潛伏期明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組、治療組與模型組比較,原平臺(tái)停留時(shí)間延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示β-細(xì)辛醚能改善快速老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力,增強(qiáng)小鼠的記憶力(表1)。

    表1 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s,s)

    表1 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s,s)

    注:與模型組比較,①P < 0.05,②P < 0.05,aP < 0.05,bP < 0.05;治療組比較,③P < 0.05,④P < 0.05;與對(duì)照組比較,⑤P < 0.05,⑥P < 0.05

    組別只數(shù) 平臺(tái)潛伏期 原平臺(tái)停留時(shí)間實(shí)驗(yàn)組治療組模型組對(duì)照組10 10 10 10 23.52 ±0.13①③24.35 ±0.20a 34.61 ±0.11⑤51.18 ±0.05 39.71 ±0.21②④37.46 ±0.04b 20.16 ±0.16⑥55.36 ±0.14

    2.2 小鼠海馬神經(jīng)元PKA、CREB測(cè)定

    小鼠海馬神經(jīng)元模型組與對(duì)照組比較,PKA、CREB吸光度(A)數(shù)值明顯降低,蛋白數(shù)量較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明模型組PKA表達(dá)減少,CREB信號(hào)表達(dá)減少。動(dòng)物給藥后實(shí)驗(yàn)組與模型組比較,PKA表達(dá)增多,CREB信號(hào)表達(dá)增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明β-細(xì)辛醚對(duì)快速老化小鼠治療有效(表2)。

    表2 各組小鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)分析(±s)

    表2 各組小鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)分析(±s)

    注:與模型組比較,①P < 0.05,②P < 0.05;與治療組比較,③P < 0.05,④P<0.05;與對(duì)照組比較,aP <0.05,bP <0.05

    組別只數(shù) PKA(A) CREB(A)實(shí)驗(yàn)組治療組模型組對(duì)照組10 10 10 10 70.12 ±0.42①③65.74 ±0.21 50.31 ±0.23a 96.17 ±0.54 85.24 ±0.38②④80.17 ±0.14 65.13 ±0.24b 88.45 ±0.69

    2.3 光學(xué)顯微鏡觀察小鼠海馬神經(jīng)元

    倒置相差顯微鏡下觀察,對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞清晰可見(jiàn),細(xì)胞形狀錐體形,細(xì)胞核清晰,細(xì)胞器豐富,可見(jiàn)明顯的尼氏體,顯示蛋白石合成旺盛(圖1a);模型組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈現(xiàn)多邊形,細(xì)胞核較小,核仁不清晰,細(xì)胞整體損傷嚴(yán)重,細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器較少(圖1b);治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形狀錐體形或、長(zhǎng)梭形,細(xì)胞器部分可以看到(圖1c);實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞少量損傷,細(xì)胞邊界較清晰,細(xì)胞形態(tài)較完整(圖1d)。

    2.4 電子顯微鏡觀察小鼠海馬神經(jīng)元

    對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形狀是錐體形,細(xì)胞器豐富,可見(jiàn)大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),神經(jīng)原纖維豐富、排列規(guī)則有序(圖2a)。模型組則小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷嚴(yán)重,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核周邊結(jié)構(gòu)混亂,脂滴較多,細(xì)胞器較少(圖2b)。治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞器清晰可見(jiàn),線(xiàn)粒體豐富,異物顆粒較少(圖2c)。實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷較少,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,神經(jīng)原纖維較豐富,突觸小泡較多(圖2d)。

    3 討論

    AD是一種臨床常見(jiàn)的老年性記憶障礙疾病,由多種原因造成,國(guó)內(nèi)外對(duì)于AD病因并不很清楚,AD的產(chǎn)生與大腦海馬神經(jīng)細(xì)胞淀粉樣蛋白沉積、膽堿能神經(jīng)纖維損傷、老年斑沉積形成、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、化學(xué)性突觸結(jié)構(gòu)改變、突觸密度喪失、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的生成減少等[3]有關(guān)。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD的發(fā)生是脾腎虧虛,痰濕阻滯,痰濁淤血所致,治療上以調(diào)節(jié)脾腎虧虛為主,痰濁淤血為輔。

    AD動(dòng)物模型首推SAM-P/8 小鼠,該模型是日本京都大學(xué)竹田俊男教授開(kāi)發(fā)的一種較理想的快速老化小鼠模型,SAM-P/8 小鼠模型壽命較短、老化較快、海馬神經(jīng)元變性壞死、小鼠腦皮質(zhì)萎縮等病理改變典型,老年性癡呆是小鼠的主要癥狀特征。本文應(yīng)用β-細(xì)辛醚觀察對(duì)快速老化SAM-P/8 小鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)影響,快速老化小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)表明,β-細(xì)辛醚可明顯改善SAM-P/8 小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力,模型組與正常組比較,尋找平臺(tái)潛伏期長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組能縮短尋找平臺(tái)潛伏期,與模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),說(shuō)明β-細(xì)辛醚對(duì)SAM-P/8 小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力有所改善。

    β-細(xì)辛醚還可以影響細(xì)胞Ca2+的代謝,通過(guò)刺激大腦海馬神經(jīng)元,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加,導(dǎo)致第二信使cAMP濃度增加,激活蛋白質(zhì)依賴(lài)的PKA磷酸化,磷酸化有活性的PKA能改善化學(xué)性突觸結(jié)構(gòu)功能改變[4-6]。活化的PKA可以磷酸化CREB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá),使各種信息可以長(zhǎng)期保存,就會(huì)記住事件的發(fā)生過(guò)程。動(dòng)物給藥后實(shí)驗(yàn)組與模型組比較,PKA表達(dá)增多,CREB信號(hào)表達(dá)增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明β-細(xì)辛醚對(duì)快速老化小鼠治療有效果。β-細(xì)辛醚可增強(qiáng)PKA蛋白的表達(dá)量,來(lái)維持大腦海馬神經(jīng)元PKA/CREB這種特殊的信號(hào)通路傳導(dǎo)。

    光鏡下對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞清晰可見(jiàn),細(xì)胞形狀錐體形,細(xì)胞核清晰,細(xì)胞器豐富,可見(jiàn)明顯的尼氏體,顯示蛋白石合成旺盛;模型組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈現(xiàn)多邊形,細(xì)胞核較小,核仁不清晰,細(xì)胞整體損傷嚴(yán)重,細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器較少;治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形狀呈錐體形或長(zhǎng)梭形,細(xì)胞器部分可以看到;實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞少量損傷,細(xì)胞邊界較清晰,細(xì)胞形態(tài)較完整,這些顯示β-細(xì)辛醚可改善老年性癡呆癡呆模型中大腦海馬神經(jīng)元的病理特點(diǎn),增強(qiáng)海馬神經(jīng)元的學(xué)習(xí)記憶能力,減弱老年性癡呆的癥狀。電鏡下模型組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷嚴(yán)重,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核周邊結(jié)構(gòu)混亂,脂滴較多,細(xì)胞器較少。治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞器清晰可見(jiàn),線(xiàn)粒體豐富,異物顆粒較少。實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷較少,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,神經(jīng)原纖維較豐富,突觸小泡較多,電鏡照片顯示β-細(xì)辛醚能減輕癡呆小鼠大腦海馬神經(jīng)元的損傷。

    綜上所述,β-細(xì)辛醚對(duì)老年癡呆的PKA/CREB信號(hào)通路有明顯的改善作用,β-細(xì)辛醚能增強(qiáng)該信號(hào)通路的傳導(dǎo),達(dá)到治療老年性癡呆的目的。

    [1] Weiner MW,Aisen PS,Jack CR Jr,et al.The Alzheimer's disease neuroimaging initiative:progress report and future plans[J].Alzheimers Dement,2010,6(3):202-211.

    [2] Latha Devi,Hindupur K.Mitochondrial trafficking of APP and alpha synuclein:relevance to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's and Parkinson's diseases[J].Biochim Biophys Acta,2010,1802(1):11-19.

    [3] Reddy PH.Amyloid beta,mitochondrial structural and functional dynamics in Alzheimer′s disease[J].Exp Neurol,2009,218(2):286-292.

    [4] Fang YQ,Shi C,Liu L,et al.Pharmacokinetics of beta-asarone in rabbit blood,hippocampus,cortex,brain stem,thalamus and cerebellum [J].Pharmazie,2012,67(2):120-123.

    [5] Liu L,F(xiàn)ang YQ,Xue ZF,et al.Beta-asarone attenuates ischemia-reperfusion-induced autophagy in rat brains via modulating JNK,p-JNK,Bcl-2 and Beclin 1[J].Eur J Pharmacol,2012,680(1-3):34-40.

    [6] Kumar R,Mohanakrishnan D,Sharma A,et al.Reinvestigation of structure-activity relationship of methoxylated chalcones as antimalarials:synthesis and evaluation of 2,4,5-trimethoxy substituted patterns as lead candidates derived from abundantly available natural β-asarone[J].Eur J Med Chem,2010,45(11):5292-5301.

    猜你喜歡
    細(xì)胞器海馬腦組織
    海馬
    我國(guó)科學(xué)家繪制“生命暗物質(zhì)”圖譜
    海馬
    細(xì)胞器
    植物細(xì)胞器DNA的新功能
    ——可作為磷酸鹽庫(kù)再利用!
    蔬菜(2018年12期)2018-01-16 05:27:32
    小腦組織壓片快速制作在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    芒果苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦組織炎癥損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    “海馬”自述
    DNA雙加氧酶TET2在老年癡呆動(dòng)物模型腦組織中的表達(dá)及其對(duì)氧化應(yīng)激中神經(jīng)元的保護(hù)作用
    海馬
    网址你懂的国产日韩在线| 有码 亚洲区| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产一区二区激情短视频| 色综合站精品国产| 精品免费久久久久久久清纯| 免费观看的影片在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 麻豆国产av国片精品| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 两人在一起打扑克的视频| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲男人的天堂狠狠| 日本在线视频免费播放| 国产精品亚洲美女久久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲无线观看免费| 免费av不卡在线播放| 国产一区二区三区视频了| 日韩欧美国产一区二区入口| www.色视频.com| 久久精品综合一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 欧美乱妇无乱码| 99热这里只有是精品在线观看 | 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩精品青青久久久久久| 少妇丰满av| 长腿黑丝高跟| 91在线精品国自产拍蜜月| 免费观看的影片在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 99热这里只有是精品50| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品亚洲美女久久久| 熟女电影av网| 一本一本综合久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 色av中文字幕| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产综合懂色| 日韩欧美在线乱码| 少妇高潮的动态图| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产伦精品一区二区三区视频9| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲综合色惰| 中文字幕熟女人妻在线| 俺也久久电影网| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲成人久久爱视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久伊人香网站| 免费观看精品视频网站| 国产在视频线在精品| 看片在线看免费视频| 欧美激情久久久久久爽电影| ponron亚洲| 日韩中字成人| 亚洲性夜色夜夜综合| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美乱妇无乱码| 久久草成人影院| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产毛片a区久久久久| 成年女人看的毛片在线观看| 国产av在哪里看| 一区福利在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美成人性av电影在线观看| 禁无遮挡网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美潮喷喷水| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 88av欧美| 老鸭窝网址在线观看| 99热6这里只有精品| 又爽又黄a免费视频| 欧美日本视频| 身体一侧抽搐| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲五月婷婷丁香| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产69精品久久久久777片| 日本在线视频免费播放| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲第一区二区三区不卡| 午夜福利欧美成人| or卡值多少钱| 精品无人区乱码1区二区| 高清在线国产一区| 黄色一级大片看看| www日本黄色视频网| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产亚洲欧美98| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品久久久久久久电影| 久久99热这里只有精品18| 极品教师在线免费播放| 亚洲国产色片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产色婷婷99| av天堂中文字幕网| 一级a爱片免费观看的视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久6这里有精品| 可以在线观看的亚洲视频| 日本在线视频免费播放| 伦理电影大哥的女人| 国产黄片美女视频| 婷婷色综合大香蕉| 听说在线观看完整版免费高清| 日韩高清综合在线| 久久99热6这里只有精品| 国产高清三级在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 黄色日韩在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| avwww免费| 国产亚洲欧美在线一区二区| 俺也久久电影网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产在线男女| 久久国产精品影院| 欧美黄色片欧美黄色片| 日韩高清综合在线| 99久久精品一区二区三区| 欧美又色又爽又黄视频| 精品久久久久久久末码| av专区在线播放| 日本五十路高清| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲av电影不卡..在线观看| 91在线观看av| 国产爱豆传媒在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 如何舔出高潮| 特级一级黄色大片| 中文亚洲av片在线观看爽| 美女免费视频网站| 免费观看人在逋| 1024手机看黄色片| 真实男女啪啪啪动态图| 黄色配什么色好看| 婷婷色综合大香蕉| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产中年淑女户外野战色| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 91av网一区二区| 国产精品日韩av在线免费观看| 久9热在线精品视频| 久久人妻av系列| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产真实伦视频高清在线观看 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲精品影视一区二区三区av| x7x7x7水蜜桃| 少妇的逼水好多| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 一a级毛片在线观看| а√天堂www在线а√下载| 成人午夜高清在线视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产av一区在线观看免费| 内射极品少妇av片p| 嫩草影视91久久| 亚洲av免费在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 人妻久久中文字幕网| 91在线观看av| 神马国产精品三级电影在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩中字成人| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品在线观看二区| 成人特级av手机在线观看| 免费观看的影片在线观看| 国产在视频线在精品| 看十八女毛片水多多多| 亚洲成人中文字幕在线播放| 中文字幕熟女人妻在线| aaaaa片日本免费| 99久久精品一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久精品欧美日韩精品| 最近在线观看免费完整版| 久久人妻av系列| 久久精品91蜜桃| www.色视频.com| 久久午夜福利片| 欧美高清性xxxxhd video| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 免费看a级黄色片| 国产黄色小视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲无线观看免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 夜夜爽天天搞| 亚洲不卡免费看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 草草在线视频免费看| 男女视频在线观看网站免费| 在线播放国产精品三级| 熟女电影av网| 国产精品一区二区三区四区久久| a在线观看视频网站| 久久人妻av系列| 国内精品美女久久久久久| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 99精品久久久久人妻精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 午夜福利18| 一个人免费在线观看电影| 色av中文字幕| 999久久久精品免费观看国产| 久久久久久久久久黄片| 桃红色精品国产亚洲av| 99热这里只有是精品在线观看 | 中文亚洲av片在线观看爽| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产成人影院久久av| 在线播放国产精品三级| 欧美日韩黄片免| 丰满人妻一区二区三区视频av| 俺也久久电影网| 国产色爽女视频免费观看| 全区人妻精品视频| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美性感艳星| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 婷婷色综合大香蕉| 久久亚洲真实| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 三级国产精品欧美在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产日本99.免费观看| av专区在线播放| 国产乱人视频| 一级毛片久久久久久久久女| 精品久久久久久成人av| 九九在线视频观看精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 1000部很黄的大片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 免费看日本二区| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲中文日韩欧美视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| av黄色大香蕉| 一区福利在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 精品人妻熟女av久视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 桃红色精品国产亚洲av| 日本成人三级电影网站| 91久久精品国产一区二区成人| 看黄色毛片网站| 黄片小视频在线播放| 99久国产av精品| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美色视频一区免费| av天堂中文字幕网| 毛片一级片免费看久久久久 | 在线观看舔阴道视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 级片在线观看| 亚洲美女视频黄频| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲自拍偷在线| 成人av在线播放网站| 麻豆成人av在线观看| 一个人免费在线观看电影| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲国产欧美人成| 丁香六月欧美| 国产精品三级大全| 看免费av毛片| 精品午夜福利在线看| 高清在线国产一区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲avbb在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品99久久久久久久久| 亚洲av电影在线进入| 三级毛片av免费| 亚洲国产高清在线一区二区三| av视频在线观看入口| 国产亚洲精品av在线| 99在线人妻在线中文字幕| 99久久成人亚洲精品观看| 久久国产乱子免费精品| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 一进一出抽搐动态| 成人毛片a级毛片在线播放| 禁无遮挡网站| 99视频精品全部免费 在线| 岛国在线免费视频观看| 搞女人的毛片| 69人妻影院| 一本综合久久免费| 亚洲性夜色夜夜综合| 真人做人爱边吃奶动态| 色哟哟·www| 高潮久久久久久久久久久不卡| www日本黄色视频网| 国产欧美日韩一区二区精品| 真实男女啪啪啪动态图| 无人区码免费观看不卡| 国产毛片a区久久久久| 哪里可以看免费的av片| 亚洲精华国产精华精| 天堂影院成人在线观看| 在线天堂最新版资源| АⅤ资源中文在线天堂| 桃色一区二区三区在线观看| 久久国产精品影院| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲经典国产精华液单 | 国产熟女xx| 90打野战视频偷拍视频| 色综合婷婷激情| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 色综合婷婷激情| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久久精品大字幕| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日日夜夜操网爽| 国产av不卡久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久久久久久久久黄片| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产高清视频在线观看网站| 99精品在免费线老司机午夜| 有码 亚洲区| 可以在线观看毛片的网站| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲精品色激情综合| 男女那种视频在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 999久久久精品免费观看国产| 国产av不卡久久| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲激情在线av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久亚洲精品不卡| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 最新中文字幕久久久久| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品永久免费网站| 97超视频在线观看视频| 男女那种视频在线观看| 国产av不卡久久| 窝窝影院91人妻| 亚洲国产欧美人成| 搡老熟女国产l中国老女人| 嫩草影院精品99| 18+在线观看网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲av.av天堂| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲激情在线av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 长腿黑丝高跟| 日韩欧美在线乱码| 一夜夜www| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 女同久久另类99精品国产91| 亚洲最大成人手机在线| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美色视频一区免费| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产成人aa在线观看| 国产乱人视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 美女免费视频网站| 99久久成人亚洲精品观看| 精品乱码久久久久久99久播| 免费观看精品视频网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美黑人巨大hd| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美成狂野欧美在线观看| 悠悠久久av| 美女 人体艺术 gogo| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产日本99.免费观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本在线视频免费播放| 亚洲精品色激情综合| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人精品一区二区免费| 一级毛片久久久久久久久女| 国产探花极品一区二区| 老鸭窝网址在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日韩av在线大香蕉| 久久香蕉精品热| 久久久久九九精品影院| 亚洲中文字幕日韩| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日韩 亚洲 欧美在线| ponron亚洲| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲美女视频黄频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 99国产精品一区二区三区| 91久久精品国产一区二区成人| 女同久久另类99精品国产91| 熟女人妻精品中文字幕| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 校园春色视频在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 成人精品一区二区免费| av视频在线观看入口| 国产视频一区二区在线看| 午夜精品在线福利| 人人妻人人澡欧美一区二区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久久成人免费电影| 日本一本二区三区精品| 亚洲欧美清纯卡通| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲人与动物交配视频| 久久国产乱子免费精品| 一本精品99久久精品77| 精品久久国产蜜桃| 亚洲最大成人中文| 禁无遮挡网站| av中文乱码字幕在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 宅男免费午夜| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久6这里有精品| 亚洲电影在线观看av| 精品人妻熟女av久视频| 欧美在线黄色| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 少妇高潮的动态图| 麻豆国产av国片精品| 国产三级在线视频| 久久精品国产亚洲av天美| 一二三四社区在线视频社区8| 韩国av一区二区三区四区| 久久6这里有精品| 欧美三级亚洲精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜精品一区二区三区免费看| 嫩草影院精品99| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成年人黄色毛片网站| 97碰自拍视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 88av欧美| 久久久久久久久久成人| 嫁个100分男人电影在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 99热这里只有精品一区| 国产高清视频在线观看网站| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲18禁久久av| 91九色精品人成在线观看| 精品久久久久久久末码| 亚洲 国产 在线| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 老司机深夜福利视频在线观看| 午夜免费激情av| 久久精品人妻少妇| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲中文日韩欧美视频| 嫩草影院入口| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲欧美清纯卡通| 最好的美女福利视频网| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 欧美高清性xxxxhd video| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久精品人妻少妇| 麻豆国产av国片精品| 日韩免费av在线播放| 一本一本综合久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久九九热精品免费| 九九在线视频观看精品| 午夜亚洲福利在线播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 舔av片在线| 亚洲,欧美,日韩| 狠狠狠狠99中文字幕| 免费无遮挡裸体视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲欧美日韩东京热| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日韩亚洲欧美综合| 两个人的视频大全免费| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩免费av在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 1000部很黄的大片| 午夜老司机福利剧场| 中文亚洲av片在线观看爽| 成人性生交大片免费视频hd| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 午夜激情欧美在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 婷婷丁香在线五月| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 午夜福利成人在线免费观看| av天堂在线播放| 性欧美人与动物交配| 精品久久久久久,| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 男人舔女人下体高潮全视频| 午夜视频国产福利| 最近最新免费中文字幕在线| 嫩草影视91久久| 精品久久久久久成人av| 九九热线精品视视频播放| 国产老妇女一区| 亚洲欧美激情综合另类| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 内射极品少妇av片p| 最近在线观看免费完整版| 在线观看一区二区三区| 看片在线看免费视频| 97热精品久久久久久| 午夜免费成人在线视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 嫩草影院精品99| 动漫黄色视频在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜福利免费观看在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品久久久久久久久免 | 国产在视频线在精品| 免费看美女性在线毛片视频| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲无线在线观看| 亚洲电影在线观看av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品日韩av在线免费观看| 精品不卡国产一区二区三区| 色视频www国产| 亚洲自偷自拍三级| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲,欧美,日韩| 简卡轻食公司| 黄色女人牲交| 国产精品99久久久久久久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲成av人片在线播放无| 十八禁人妻一区二区| 精品人妻视频免费看| 欧美最黄视频在线播放免费| 97热精品久久久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美潮喷喷水| a在线观看视频网站| 亚洲精品成人久久久久久| 中文字幕av在线有码专区| www.www免费av| www日本黄色视频网| 日韩欧美在线乱码| 日韩亚洲欧美综合| 国产免费av片在线观看野外av| 色5月婷婷丁香| 精品熟女少妇八av免费久了| 宅男免费午夜| 婷婷亚洲欧美| 国产亚洲欧美98| 亚洲国产欧美人成|