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    β-細(xì)辛醚通過(guò)PKA/CREB信號(hào)通路對(duì)快速老化癡呆小鼠腦組織凋亡機(jī)制的影響

    2012-09-17 06:33:20費(fèi)洪新李曉明牛英才劉向民周
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞器海馬腦組織

    王 睿 費(fèi)洪新 李曉明 王 偉 劉 韓 牛英才 劉向民周 濤

    1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006

    阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,老年人多發(fā),喪失生活能力,主要是在大腦海馬區(qū)域出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì),即淀粉樣β蛋白 (amyloid β protein,Aβ),Aβ可以使組織產(chǎn)生大量自由基,干擾鈣離子代謝,影響炎癥反應(yīng),從而引起腦神經(jīng)元發(fā)生改變,神經(jīng)元功能也會(huì)發(fā)生改變,引起AD發(fā)生[1-2],癥狀上表現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶障礙是最早出現(xiàn)的,目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)特效藥物進(jìn)行治療。石菖蒲揮發(fā)油是對(duì)機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用有效成分,其中β-細(xì)辛醚是石菖蒲揮發(fā)油的主要成分,β-細(xì)辛醚對(duì)機(jī)體自由基的產(chǎn)生有重要作用,是治療神經(jīng)系統(tǒng)的一種藥物。β-細(xì)辛醚可促進(jìn)氧自由基代謝,影響大腦學(xué)習(xí)和記憶能力。本文筆者通過(guò)將飼養(yǎng)動(dòng)物分組后給予β-細(xì)辛醚探討AD發(fā)病原因,且觀察對(duì)老年癡呆小鼠PKA/CREB信號(hào)通路的影響作用和快速老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響,分析β-細(xì)辛醚藥物作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與儀器 β-細(xì)辛醚購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司,制成0.1 mg/mL混濁液,每天小鼠灌胃量是2 mL;PKA、CREB一抗、SP試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;DydatechMR4000 型酶標(biāo)儀購(gòu)自SantaCruz公司,MPIAS-500 病理圖像分析系統(tǒng)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供,其他均為國(guó)產(chǎn)分析醇試劑。

    1.1.2 動(dòng)物分組 選取健康昆明小鼠10只和快速老化小鼠30只,均為10個(gè)月大小、雄性、體重20~25 g,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。健康昆明小鼠10只作為對(duì)照組,30只快速老化小鼠物隨機(jī)分為模型組(10只)、實(shí)驗(yàn)組(10只)、治療組(10只)。對(duì)照組采用生理鹽水灌胃,2 mL/次;實(shí)驗(yàn)組采用β-細(xì)辛醚混濁液灌胃,2 mL/次;治療組采用腦復(fù)康水溶液5 mg/mL灌胃,2 mL/次;模型組采用生理鹽水灌胃,2 mL/次。所有小鼠均每天灌胃1次,持續(xù)3周。

    1.2 方法

    1.2.1 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃3周后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,連續(xù)5 d,實(shí)驗(yàn)前1 d適應(yīng)性訓(xùn)練,平臺(tái)放在第一象限,其他3個(gè)象限將其放入水中,每天各測(cè)1次,在2 min內(nèi)尚未找到平臺(tái),則將其放平臺(tái)10 s;若120 s之內(nèi)找到平臺(tái),則其在平臺(tái)10 s,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5 d。利用上臺(tái)潛伏期代表實(shí)驗(yàn)小鼠的空間學(xué)習(xí)能力,采用Morrismicrosoft基礎(chǔ)類(lèi)應(yīng)用程序紀(jì)錄逃避潛伏期和游泳距離,兩次潛伏期算術(shù)均值作為這一天成績(jī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,處理結(jié)果。

    1.2.2 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行空間探索試驗(yàn)是任選一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠放入水池中進(jìn)行試驗(yàn),記錄各組實(shí)驗(yàn)小鼠在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)游泳軌跡,考察各組實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)原平臺(tái)記憶,選擇任選一相同入水點(diǎn)將各組實(shí)驗(yàn)小鼠放入水池中,記錄各組實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2 min之內(nèi)游泳路線(xiàn),同時(shí)記錄停留時(shí)間,并對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,處理結(jié)果。

    1.2.3 PKA、CREB的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)小鼠乙醚麻醉,斷頭取出含有海馬組織的腦組織,福爾馬林固定24 h,PBS洗滌,4℃保存12 h,梯度乙醇脫水,透明,浸蠟,石蠟包埋,切片組織厚度6 μm,采用海馬組織分別測(cè)定PKA、CREB,37℃溫箱孵育10 min,PBS洗滌,抗原修復(fù)10 min,正常羊血清37℃溫箱孵育10 min,一抗 (PKA、CREB 為 1 100)37℃溫箱孵育 1 h,PBS 洗滌,二抗 IgG-HRP加入后,37℃溫箱孵育 30 min,PBS洗滌,DAB顯色液顯色,PBS洗滌,蘇木精染色,脫水,透明,封片,測(cè)定部位在海馬區(qū),使用病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定吸光度值,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

    1.2.4 小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)光鏡觀察 實(shí)驗(yàn)小鼠乙醚麻醉,斷頭處死,取出腦組織,沿冠狀切面切下前囟尾側(cè)2.2~4.3 mm的海馬組織,福爾馬林固定,PBS洗滌,4℃保存12 h,梯度乙醇脫水,透明,浸蠟,石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚7 μm,HE染色,光鏡下觀察拍照。

    1.2.5 小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)電鏡觀察 實(shí)驗(yàn)小鼠乙醚麻醉,打胸后心臟灌注固定液,快速取腦,分離海馬,2.5%戊二醛預(yù)固定2 h、四氧化鋨固定,梯度乙醇脫水,透明,浸蠟,石蠟包埋,連續(xù)切片,醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色,電鏡下觀察拍照。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,模型組與對(duì)照組比較,平臺(tái)潛伏期縮短,原平臺(tái)停留時(shí)間縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明模型穩(wěn)定,可以用于實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)組、治療組與模型組比較,潛伏期明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組、治療組與模型組比較,原平臺(tái)停留時(shí)間延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示β-細(xì)辛醚能改善快速老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力,增強(qiáng)小鼠的記憶力(表1)。

    表1 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s,s)

    表1 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s,s)

    注:與模型組比較,①P < 0.05,②P < 0.05,aP < 0.05,bP < 0.05;治療組比較,③P < 0.05,④P < 0.05;與對(duì)照組比較,⑤P < 0.05,⑥P < 0.05

    組別只數(shù) 平臺(tái)潛伏期 原平臺(tái)停留時(shí)間實(shí)驗(yàn)組治療組模型組對(duì)照組10 10 10 10 23.52 ±0.13①③24.35 ±0.20a 34.61 ±0.11⑤51.18 ±0.05 39.71 ±0.21②④37.46 ±0.04b 20.16 ±0.16⑥55.36 ±0.14

    2.2 小鼠海馬神經(jīng)元PKA、CREB測(cè)定

    小鼠海馬神經(jīng)元模型組與對(duì)照組比較,PKA、CREB吸光度(A)數(shù)值明顯降低,蛋白數(shù)量較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明模型組PKA表達(dá)減少,CREB信號(hào)表達(dá)減少。動(dòng)物給藥后實(shí)驗(yàn)組與模型組比較,PKA表達(dá)增多,CREB信號(hào)表達(dá)增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明β-細(xì)辛醚對(duì)快速老化小鼠治療有效(表2)。

    表2 各組小鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)分析(±s)

    表2 各組小鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)分析(±s)

    注:與模型組比較,①P < 0.05,②P < 0.05;與治療組比較,③P < 0.05,④P<0.05;與對(duì)照組比較,aP <0.05,bP <0.05

    組別只數(shù) PKA(A) CREB(A)實(shí)驗(yàn)組治療組模型組對(duì)照組10 10 10 10 70.12 ±0.42①③65.74 ±0.21 50.31 ±0.23a 96.17 ±0.54 85.24 ±0.38②④80.17 ±0.14 65.13 ±0.24b 88.45 ±0.69

    2.3 光學(xué)顯微鏡觀察小鼠海馬神經(jīng)元

    倒置相差顯微鏡下觀察,對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞清晰可見(jiàn),細(xì)胞形狀錐體形,細(xì)胞核清晰,細(xì)胞器豐富,可見(jiàn)明顯的尼氏體,顯示蛋白石合成旺盛(圖1a);模型組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈現(xiàn)多邊形,細(xì)胞核較小,核仁不清晰,細(xì)胞整體損傷嚴(yán)重,細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器較少(圖1b);治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形狀錐體形或、長(zhǎng)梭形,細(xì)胞器部分可以看到(圖1c);實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞少量損傷,細(xì)胞邊界較清晰,細(xì)胞形態(tài)較完整(圖1d)。

    2.4 電子顯微鏡觀察小鼠海馬神經(jīng)元

    對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形狀是錐體形,細(xì)胞器豐富,可見(jiàn)大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),神經(jīng)原纖維豐富、排列規(guī)則有序(圖2a)。模型組則小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷嚴(yán)重,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核周邊結(jié)構(gòu)混亂,脂滴較多,細(xì)胞器較少(圖2b)。治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞器清晰可見(jiàn),線(xiàn)粒體豐富,異物顆粒較少(圖2c)。實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷較少,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,神經(jīng)原纖維較豐富,突觸小泡較多(圖2d)。

    3 討論

    AD是一種臨床常見(jiàn)的老年性記憶障礙疾病,由多種原因造成,國(guó)內(nèi)外對(duì)于AD病因并不很清楚,AD的產(chǎn)生與大腦海馬神經(jīng)細(xì)胞淀粉樣蛋白沉積、膽堿能神經(jīng)纖維損傷、老年斑沉積形成、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、化學(xué)性突觸結(jié)構(gòu)改變、突觸密度喪失、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的生成減少等[3]有關(guān)。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD的發(fā)生是脾腎虧虛,痰濕阻滯,痰濁淤血所致,治療上以調(diào)節(jié)脾腎虧虛為主,痰濁淤血為輔。

    AD動(dòng)物模型首推SAM-P/8 小鼠,該模型是日本京都大學(xué)竹田俊男教授開(kāi)發(fā)的一種較理想的快速老化小鼠模型,SAM-P/8 小鼠模型壽命較短、老化較快、海馬神經(jīng)元變性壞死、小鼠腦皮質(zhì)萎縮等病理改變典型,老年性癡呆是小鼠的主要癥狀特征。本文應(yīng)用β-細(xì)辛醚觀察對(duì)快速老化SAM-P/8 小鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)影響,快速老化小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)表明,β-細(xì)辛醚可明顯改善SAM-P/8 小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力,模型組與正常組比較,尋找平臺(tái)潛伏期長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組能縮短尋找平臺(tái)潛伏期,與模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),說(shuō)明β-細(xì)辛醚對(duì)SAM-P/8 小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力有所改善。

    β-細(xì)辛醚還可以影響細(xì)胞Ca2+的代謝,通過(guò)刺激大腦海馬神經(jīng)元,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加,導(dǎo)致第二信使cAMP濃度增加,激活蛋白質(zhì)依賴(lài)的PKA磷酸化,磷酸化有活性的PKA能改善化學(xué)性突觸結(jié)構(gòu)功能改變[4-6]。活化的PKA可以磷酸化CREB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá),使各種信息可以長(zhǎng)期保存,就會(huì)記住事件的發(fā)生過(guò)程。動(dòng)物給藥后實(shí)驗(yàn)組與模型組比較,PKA表達(dá)增多,CREB信號(hào)表達(dá)增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明β-細(xì)辛醚對(duì)快速老化小鼠治療有效果。β-細(xì)辛醚可增強(qiáng)PKA蛋白的表達(dá)量,來(lái)維持大腦海馬神經(jīng)元PKA/CREB這種特殊的信號(hào)通路傳導(dǎo)。

    光鏡下對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞清晰可見(jiàn),細(xì)胞形狀錐體形,細(xì)胞核清晰,細(xì)胞器豐富,可見(jiàn)明顯的尼氏體,顯示蛋白石合成旺盛;模型組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈現(xiàn)多邊形,細(xì)胞核較小,核仁不清晰,細(xì)胞整體損傷嚴(yán)重,細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器較少;治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞形狀呈錐體形或長(zhǎng)梭形,細(xì)胞器部分可以看到;實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞少量損傷,細(xì)胞邊界較清晰,細(xì)胞形態(tài)較完整,這些顯示β-細(xì)辛醚可改善老年性癡呆癡呆模型中大腦海馬神經(jīng)元的病理特點(diǎn),增強(qiáng)海馬神經(jīng)元的學(xué)習(xí)記憶能力,減弱老年性癡呆的癥狀。電鏡下模型組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷嚴(yán)重,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核周邊結(jié)構(gòu)混亂,脂滴較多,細(xì)胞器較少。治療組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞器清晰可見(jiàn),線(xiàn)粒體豐富,異物顆粒較少。實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬神經(jīng)元腦組織錐體細(xì)胞損傷較少,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,神經(jīng)原纖維較豐富,突觸小泡較多,電鏡照片顯示β-細(xì)辛醚能減輕癡呆小鼠大腦海馬神經(jīng)元的損傷。

    綜上所述,β-細(xì)辛醚對(duì)老年癡呆的PKA/CREB信號(hào)通路有明顯的改善作用,β-細(xì)辛醚能增強(qiáng)該信號(hào)通路的傳導(dǎo),達(dá)到治療老年性癡呆的目的。

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