辛伐他汀對(duì)缺血再灌注損傷大鼠腎臟的保護(hù)作用

鄒 飛 蔣祥林 譚 毅 朱文勝 楊 松 陳 勇 孫厚良

1.重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院泌尿外科，重慶 404000；2.重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶 404120

腎臟在缺血再灌注（IR）過(guò)程中會(huì)嚴(yán)重影響其生理功能，如何減輕腎缺血再灌注損傷（IRI），成為目前研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞在受到應(yīng)激刺激時(shí)，會(huì)啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[1]，HO-1 就是其中的一種方式[2]，它可被許多因素誘導(dǎo)而表達(dá)[3]。HO-1 與IRI密切相關(guān)[4]，其分解血紅素得到的產(chǎn)物中有重要的自由基清除劑及抗IRI因子[5]。關(guān)于他汀類(lèi)藥物的體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)該藥物能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞中HO-1 的表達(dá)[6]而發(fā)揮血管保護(hù)功能。在心、腦等器官的IR過(guò)程中，辛伐他?。⊿imvastatin）能誘導(dǎo)HO-1 高表達(dá)減輕其損傷[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用腎臟IRI大鼠模型，應(yīng)用Simvastatin干預(yù)，觀察其對(duì)腎臟IRI組織中HO-1 表達(dá)以及腎臟組織炎癥反應(yīng)程度的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組

健康雄性 Wistar大鼠 40只，體重（250 ±20）g。 大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境7 d后隨機(jī)分四組：Simvastatin組、IR組、鋅原卟啉（ZnPP）組、假手術(shù)（sham）組，每組各 10只。

1.2 IRI模型制備

Simvastatin 組術(shù)前給予 Simvastatin 10 mg/（kg·d）灌胃 7 d；IR組術(shù)前給予等體積生理鹽水灌胃7 d；ZnPP組術(shù)前24 h給予HO-1 抑制劑ZnPP 5 mg/kg腹腔注射；sham組常規(guī)飼養(yǎng)。各組末次給藥24 h后，全部大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg予以麻醉，從腹正中行4 cm縱行切口打開(kāi)腹腔，仔細(xì)分離右腎蒂及腎周筋膜，充分游離右側(cè)腎臟后結(jié)扎右腎蒂并切除右腎；同法分離左側(cè)腎臟腎蒂，充分顯露左腎動(dòng)脈及腎臟組織，除sham組外均用動(dòng)脈夾夾閉左腎蒂45 min，再灌注左腎，觀察左腎色澤由暗紅色變?yōu)轷r紅色，表明灌注成功。還納腸管于腹腔原位并縫合切口，放回原飼養(yǎng)場(chǎng)所待自然清醒并自由飲食。

1.3 標(biāo)本制備及檢測(cè)

1.3.1 尿素氮、肌酐水平測(cè)定 再灌注24 h后，抽取下腔靜脈血樣約3 mL，10 000 r/min離心10 min，上清置于-20℃冰箱保存。AU400 生化分析儀測(cè)量血BUN、Cr水平。

1.3.2 腎臟組織學(xué)觀察及HO-1 免疫組化測(cè)定 抽血后處死大鼠取左腎，用于組織學(xué)觀察的腎組織按照切片制備要求處理并保存，然后按免疫組化三步法制備切片。結(jié)果判斷：HO-1陽(yáng)性反應(yīng)為胞質(zhì)呈棕黃色顆粒染色，采用病理圖像分析軟件半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清尿素氮、肌酐水平比較

與sham組比較，另三組大鼠都有不同程度的腎功能損害（P<0.01）；與 IR 及 ZnPP 組相比，Simvastatin 組 BUN、Cr值明顯較低（P<0.01）；ZnPP組腎功能損傷重于IR組（P<0.01）。 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠尿素氮、肌酐水平比較（±s）

表1 各組大鼠尿素氮、肌酐水平比較（±s）

注：與 sham 組比較，*P<0.01；與 IR 組比較，▲P<0.01；與 ZnPP組比較，★P<0.01

組別只數(shù) 尿素氮（mmol/L） 肌酐（μmol/L）IR組Simvastatin組sham組ZnPP組10 10 10 10 38.62 ±2.60*16.88 ±1.74*▲★7.03 ±0.37 58.79 ±3.96*▲377.74 ±8.63*158.73 ±3.57*▲★69.03 ±2.00 600.64 ±10.16*▲

2.2 各組大鼠腎臟病理變化的比較

取平展、細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)清晰的組織切片，依據(jù)Paller法[9]可見(jiàn)，ZnPP組腎臟損傷最重，以管型形成、腎間質(zhì)出血并炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主；除sham組外，Simvastatin組腎臟損傷最輕，僅見(jiàn)部分輕度水腫樣變性，偶見(jiàn)管型及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與sham組比較，各組腎小管評(píng)分均較高（P<0.05）；與IR組相比，Simvastatin組腎小管評(píng)分明顯降低（P<0.05），表明Simvastatin的應(yīng)用可減輕大鼠腎組織損傷。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎小管評(píng)分比較（±s，分）

表2 各組大鼠腎小管評(píng)分比較（±s，分）

注：與 sham組比較，*P<0.05；與 IR組比較，▲P<0.05；與 ZnPP組比較，★P<0.05

組別只數(shù) 腎小管評(píng)分IR組Simvastatin組sham組ZnPP組10 10 10 10 104.38 ±5.57*39.51 ±1.6*▲★26.43 ±2.05 239.70 ±4.7*▲

2.3 各組大鼠HO-1 表達(dá)水平比較

用半定量分析法，光鏡下觀察被染成棕褐色細(xì)胞的分布情況，無(wú)染色為0分，偶有染色為1分，局灶染色為2分，彌漫染色為3分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZnPP組HO-1 幾乎不表達(dá)，假手術(shù)組僅有微量表達(dá)，IR組呈局灶性表達(dá)，Simvastatin組HO-1表達(dá)最強(qiáng)。與sham組相比，另外三組HO-1 表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Simvastatin組HO-1 的表達(dá)高于其他組（P<0.05），說(shuō)明應(yīng)用Simvastatin可以提高HO-1 表達(dá)水平；應(yīng)用ZnPP后，HO-1 基本不表達(dá)。見(jiàn)表3。

3 討論

他汀類(lèi)藥物又稱(chēng)HMG-CoA還原酶抑制劑，是經(jīng)典和有效的降脂藥物，已廣泛應(yīng)用于腎臟疾病的治療。該類(lèi)藥物不僅具有降血脂的功能，而且還能保護(hù)腎臟，延緩腎臟疾病進(jìn)展[10]。目前研究已證實(shí)在心臟、肝臟的IRI中，HO-1 的高表達(dá)可有效地保護(hù)臟器的結(jié)構(gòu)并改善其功能[11-12]。

Cr是肌酸的代謝終產(chǎn)物，而B(niǎo)UN是體內(nèi)蛋白氮代謝的終產(chǎn)物，主要通過(guò)腎臟排泄，依據(jù)二者的含量變化可評(píng)估腎功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎臟IRI后大鼠血清Cr和BUN明顯增高，而Simvastatin可以明顯降低腎IRI大鼠血清Cr和BUN值。從光鏡可以看到，單純IR大鼠的腎組織切片中有腫脹明顯的上皮細(xì)胞，該類(lèi)細(xì)胞有程度不一的變性、壞死，間質(zhì)可見(jiàn)明顯充血水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；相反Simvastatin組僅見(jiàn)輕度細(xì)胞腫脹，未見(jiàn)典型的缺血性改變。這些結(jié)果不僅說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)?zāi)IIRI模型建立成功，而且提示Simvastatin對(duì)急性腎IRI具有明顯的保護(hù)作用。

表3 各組大鼠HO-1表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠HO-1表達(dá)水平比較（±s）

注：與 sham 組比較，*P<0.05；與 IR 組比較，▲P<0.05；與 ZnPP組比較，★P<0.05

組別只數(shù) HO-1 表達(dá)水平IR組Simvastatin組sham組ZnPP組10 10 10 10 2.40 ±0.5*3.0 ±0.2*▲★0.4 ±0.1 0*▲

自20 世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)HO-1 并證實(shí)其具有和熱休克蛋白32 相同的結(jié)構(gòu)后，引發(fā)了人們對(duì)HO-1 作為應(yīng)激反應(yīng)蛋白新的認(rèn)識(shí)。Stocker[13]發(fā)現(xiàn)在各種形式的氧化應(yīng)激下HO-1均被誘導(dǎo)激活，于1990年提出這種酶可能對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，無(wú)論體內(nèi)還是體外，HO-1 是一種保護(hù)各種活性氧和活性氮所致氧化損傷的潛在抗氧化劑[14]。應(yīng)用HO-1 基因敲除的腎損傷動(dòng)物模型，Nath等[15]證實(shí)，HO-1 的表達(dá)是阻止腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)及炎癥因子基因表達(dá)所必需的。筆者在本研究中除建立IRI模型外還應(yīng)用HO-1 抑制劑ZnPP作為對(duì)照進(jìn)一步觀察HO-1 是否在腎IRI過(guò)程中發(fā)揮作用，ZnPP對(duì)HO-1 的抑制主要是通過(guò)促進(jìn)組織釋放大量的微粒體血紅素實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎IRI作為應(yīng)激原可誘導(dǎo)HO-1 的表達(dá)，但并不能阻止腎臟損害的發(fā)生，如果在腎臟IRI前應(yīng)用Simvastatin誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)，則可明顯改善腎功能，減輕腎臟損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sham組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，幾乎無(wú)HO-1 表達(dá)；IR組腎小管上皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)不同程度的變性、壞死，HO-1 表達(dá)較sham組顯著增強(qiáng)；Simvastatin組缺血性改變較IR組明顯減輕，接近正常，HO-1 表達(dá)較高。Simvastatin使HO-1 表達(dá)上調(diào)，可能是Simvastatin在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)腎缺血細(xì)胞HO-1 的表達(dá)，從而使HO-1 合成增加，使得腎臟對(duì)缺血及氧化損傷的抵抗能力增加，顯著改善大鼠腎臟IRI。目前的研究報(bào)道顯示，他汀類(lèi)藥物通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶和核因子E2 相關(guān)因子2 等信號(hào)通路調(diào)節(jié)HO-1 的表達(dá)[16]，但作為一種腎缺血再灌注的保護(hù)藥物，在最佳劑量、安全性方面有待于進(jìn)一步研究。

[1] 吳剛，梁健，成東華，等.HSP70 和HO-1 誘導(dǎo)對(duì)鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，33（2）：125-127.

[2] 劉明，趙曉宇，周虹.血紅素氧化酶-1 在缺血/再灌注損傷中的保護(hù)作用[J].生命的化學(xué)，2004，24（1）：50-52.

[3] Kanwar YS.Heme oxygenase-1 in renal injury：Conclusions of studies in humans and animalmodels[J].Kidney Int，2001，59（1）：378.

[4] Zheng D，Yan L，Manjeri A，et al.Heme oxygenase-1 in tissue pathology：The Yin and Yang[J].Amer J Path，2000，156：1485-1488.

[5] Masamichi K，Ronald W，Jerzy W，et al.Heme oxygenase-1 system in organ transplantation[J].Transplantation，2002，74：905-912.

[6] Lee TS，Chang CC，Zhu Y，et al.Simvastatin induces heme oxygenase-1：a novel mechanism of vessel protection[J].Circulation，2004，110（10）：1296-1302.

[7] 陳亂穎，覃數(shù)，向睿，等.辛伐他汀對(duì)急性心肌梗死大鼠血紅素加氧酶-1 的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（4）：535-538.

[8] 武棋，李欣.辛伐他汀對(duì)腦缺血-再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國(guó)腦血管病雜志，2007，4（9）：410-413.

[9] Paller MS，Hoidal JR，F(xiàn)erris TF.Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat[J].J Clin Invest，1984，74（4）：1156-1164.

[10] Sukhija R，Bursae Z，Kakar P， et al.Effect of statins on the development of renal dysfunction[J].Am J Cardiol，2008，101（7）：975-979.

[11] Katori M，Buelow R，Ke B，et al.Heme oxygenase-1 overexpression protects rat hearts from cold isehemia/reperfusion injury via an anti-apoptotic pathway[J].Transplantation，2002，73（2）：287-292.

[12] 汪寶軍，竹潤(rùn)芳，岳云霄，等.巴戟天寡糖對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2009，11（4）：625-626，629.

[13] Stocker R.Induction of heme oxygenase as a defense against odxidative stress[J].Free Rad Res Commun，1990，9（4）：101-112.

[14] 關(guān)里，溫韜，張雁林，等.血紅素加氧酶的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J].中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2007，20（3）：180-182.

[15] Nath KA，Vercellotti SM，Grande JP，et al.Heme protein induced chronic renal inflammation：suppressive effect of induced heme oxygenase-1[J].Kidney Int，2001，59（1）：106-117.

[16] Kim YM，Pae O，Park JE，et al.Heme oxygenase in the regulation of vascular biology：from molecular mechanisms to therapeutic opportunities[J].Antioxid Redox Signal，2011，14（1）：137.