巴戟天醇提物對(duì)離體大鼠缺血再灌注損傷心肌能量代謝的影響

劉靈芝

鄭州人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南鄭州 450003

心缺血再灌注損傷 （ischemia-reperfusion injury，IRI）是指心肌較長(zhǎng)時(shí)間缺血造成一定損傷后，恢復(fù)血供，不但不能減輕或逆轉(zhuǎn)損傷，反而加重?fù)p傷的一種病理生理現(xiàn)象，常見(jiàn)于臨床上急性心肌梗死及缺血性心臟病的治療過(guò)程中，主要形成機(jī)制包括心肌細(xì)胞能量代謝障礙、鈣超載、自由基損傷、線粒體功能損傷及心肌細(xì)胞凋亡等[1]。巴戟天屬于茜草科植物，肉質(zhì)根可以入藥，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)之功效。以往的研究表明，巴戟天醇提物具有減輕心肌IRI的作用，且這種作用可能與其能夠減輕IRI心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化及細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]。近年來(lái)，隨著心肌IRI機(jī)制的研究進(jìn)展，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)能量代謝的改變?cè)谛募RI形成過(guò)程可能發(fā)揮一定的作用，但巴戟天醇提物對(duì)IRI心肌能量代謝的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者利用Langendorff灌流裝置制備離體大鼠心臟IRI模型，探討巴戟天醇提物對(duì)大鼠IRI心肌能量代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 巴戟天購(gòu)自廣東省德慶縣藥材公司，一等品，由河南省食品藥品檢驗(yàn)所鑒定，由所購(gòu)生藥提取得到巴戟天醇提物；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）及一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）3 種物質(zhì)的鈉鹽均購(gòu)自 Amresco公司，批號(hào)分別為0614、0340、0712；其他試劑均為國(guó)內(nèi)分析純。

1.1.2 儀器 Langendorff灌流裝置（上海奧爾科特生物科技有限公司）；高效液相色譜儀（SPD-10A紫外檢測(cè)器、CLASS-VP色譜工作站）（日本島津公司）；Scienhome C18色譜柱（250 nm×4.6 nm，5 μm）（天津市琛航科技儀器有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量265～295 g，平均（278 ±16）g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 離體心臟灌流模型的建立 大鼠采取腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉（0.2 μL/g）進(jìn)行麻醉，同時(shí)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%肝素鈉（0.1 μL/g）抗凝；開(kāi)胸取出心臟，置入盛有 0～4℃預(yù)冷灌流液的器皿中，用灌流液沖洗后，于Langendorff灌流裝置上開(kāi)始進(jìn)行灌流。灌流壓：82 kPa，用Krebs-Hanseleit磷酸緩沖液作為灌流液。其成分（mmol/L）如下：NaCl 118，NaHCO325.0，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 1.2，CaCl222.5，Glucose 11.0，pH為7.4，滲透壓達(dá)到了300 mOsm/L；灌流前用體積分?jǐn)?shù)95%O2+5%CO2混合氣體平衡15 min，灌流過(guò)程中保持，保持裝置內(nèi)溫度處于37℃，并持續(xù)通氣。

1.2.2 分組及處理 40只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、IRI組、巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組四組，每組10只大鼠。空白對(duì)照組：持續(xù)灌流110 min；IRI組：預(yù)灌20 min，保持37℃條件下，停灌60 min，再?gòu)?fù)灌30 min；巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組：分別在預(yù)灌時(shí)加入濃度為600、300 mg/L巴戟天醇提物，其他處理同IRI組。

1.2.3 高能磷酸化合物的測(cè)定 灌流結(jié)束后，每只大鼠心臟立即剪取左心室100 mg，采用0.42 mol/L預(yù)冷高氯酸制成勻漿，采用1.00 mol/L氫氧化鉀進(jìn)行中和，采用超聲波細(xì)胞粉碎器粉碎線粒體膜（在冰水中進(jìn)行）。4℃情況下，以10 000 r/min的速度離心10 min；吸取20 μL上清液采用高相液相色譜儀測(cè)定各種高能磷酸化合物含量，色譜條件：由215 mmol/L的KH2PO4和3.5%乙腈組成流動(dòng)相，然后用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.1，流速控制在0.5mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。得到ATP、ADP、AMP檢測(cè)結(jié)果后計(jì)算心肌總腺嘌呤核苷酸含量 （total adenine nucleotides，TAN）及心肌細(xì)胞能荷（energy charge，EC）， 其 中 TAN=ATP+ADP+AMP，EC=（ATP+0.5 ×ADP）/TAN。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，TAP、ADP、AMP、TAN及EC等計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

IRI組的 ATP、ADP、AMP、TAN 及 EC低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。與IRI組相比，巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組的TAP、ADP、AMP、TAN及EC升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組的TAP、ADP、AMP、TAN及EC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。 見(jiàn)表1。

3 討論

心肌IRI是一個(gè)受多因素影響的復(fù)雜病理生理過(guò)程，其中能量代謝障礙、生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、氧自由基的產(chǎn)生過(guò)多或清除障礙、心肌細(xì)胞凋亡等機(jī)制研究較為徹底[3-5]。

表1 離體大鼠心肌組織中高能磷酸化合物的含量（±s，n＝10）

表1 離體大鼠心肌組織中高能磷酸化合物的含量（±s，n＝10）

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.05；與IRI組比較，*P<0.05；與巴戟天高劑量組比較，※P<0.05

組別 ATP（mg/100 g） ADP （mg/100 g） AMP（mg/100 g） TAN（mg/100 g） EC空白對(duì)照組IRI組巴戟天高劑量組巴戟天低劑量組F值P值25.26 ±4.27 7.98 ±1.49△15.94 ±2.73*12.49 ±2.54*※62.982<0.01 82.39 ±5.90 14.33 ±2.95△42.38 ±4.55*23.57 ±4.48*※419.460<0.01 78.33 ±9.14 39.34 ±3.03△60.03 ±8.34*53.24 ±5.67*※49.073<0.01 185.98 ±10.53 61.65 ±3.29△118.35 ±10.17*89.30 ±5.60*※448.490<0.01 0.36 ±0.03 0.25 ±0.02△0.31 ±0.04*0.28 ±0.03*※25.450<0.01

近年來(lái)，有學(xué)者[6-7]提出能量代謝障礙是心肌IRI的始動(dòng)因子，ATP的正常合成和保存在保護(hù)心肌結(jié)構(gòu)和功能完整中起著重要作用，而且心肌細(xì)胞發(fā)揮正常功能離不開(kāi)ATP提供的能量。當(dāng)心肌發(fā)生缺血時(shí)，心肌細(xì)胞獲取能量的途徑由有氧代謝變?yōu)闊o(wú)氧糖酵解，然而兩者產(chǎn)生ATP的效力差異較大，后者僅為前者的1/18，這一變化造成了心肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量急速下降，根本無(wú)法滿足心肌細(xì)胞正常生存的基本需要，最終這些變化造成心肌細(xì)胞能量代謝障礙及心肌組織結(jié)構(gòu)和功能的喪失，同時(shí)ATP含量的下降還影響細(xì)胞膜上依靠ATP的泵的功能，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載和氧自由基產(chǎn)生過(guò)多[6-8]。ATP、ADP、AMP、TAN 及 EC 是心肌能量代謝研究領(lǐng)域的重要觀察指標(biāo)，這些指標(biāo)的變化能夠直觀反映心肌細(xì)胞的能量代謝情況，例如ATP的含量不僅可以反映線粒體的氧化呼吸火星和合成高能磷酸化合物的能力，而且還可以反映心肌細(xì)胞的能量存儲(chǔ)狀況；EC也是反映心肌能量代謝的重要指標(biāo)，其與線粒體氧化磷酸化功能和能量代謝狀況關(guān)系密切，EC的降低說(shuō)明可利用高能磷酸化合物含量減少[9]。另外，ATP合成不能夠滿足需求時(shí)，心肌細(xì)胞所需能量主要來(lái)源于ATP按照ATP、ADP、AMP、腺苷、次黃嘌呤的順序降解，然而這也進(jìn)一步加重了各種能量物質(zhì)及其總量的減少，還有EC的降低。

本研究結(jié)果顯示：IRI組的心肌組織中ATP、ADP、AMP、TAN及EC均低于空白對(duì)照組，提示心肌能量代謝障礙可能作為心肌發(fā)生IRI的病理生理基礎(chǔ)；巴戟天醇提物兩個(gè)劑量組的 ATP、ADP、AMP、TAN 及 EC 高于 IRI組，提示巴戟天醇提物具有改善心肌細(xì)胞能量代謝的作用，這可能與其能夠保護(hù)線粒體的氧化呼吸活性，增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化功能和生成高能磷酸化合物的能力，使心肌細(xì)胞可利用高能磷酸化合物含量增加等有關(guān)[8]。

綜上所述，巴戟天醇提物能夠改善IRI心肌的能量代謝，但其影響能量代謝的具體機(jī)制尚不明確，尚需進(jìn)一步深入研究證實(shí)，另外，由于能量代謝障礙是心肌IRI的始動(dòng)因子，所以巴戟天醇提物可能通過(guò)該途徑發(fā)揮保護(hù)IRI心肌的作用。

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