重組表達(dá)乙肝病毒x蛋白的腺病毒構(gòu)建及在HepG2細(xì)胞的表達(dá)*

張紅飛，李軍鋒，戶 義，張慧娜，鮑春旸，王凱娟#，周育森

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室鄭州450001 2)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100071

重組表達(dá)乙肝病毒x蛋白的腺病毒構(gòu)建及在HepG2細(xì)胞的表達(dá)*

張紅飛1，2)，李軍鋒2)，戶 義2)，張慧娜1)，鮑春旸2)，王凱娟1)#，周育森2)

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室鄭州450001 2)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100071

#通訊作者，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向:腫瘤流行病學(xué)，E-mail:kjwang@163.com

腺病毒載體;HBx基因;肝癌細(xì)胞

目的:構(gòu)建重組表達(dá)HBx的腺病毒，并通過感染細(xì)胞建立HBx高表達(dá)的細(xì)胞模型。方法:首先將HBx基因插入腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack中，限制性酶切鑒定正確后將其用PmeⅠ酶切線性化，轉(zhuǎn)到BJ5183感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行同源重組，重組后的腺病毒載體pAd-HBx經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，轉(zhuǎn)染到QBI-293A細(xì)胞中，根據(jù)EGFP的表達(dá)判斷重組腺病毒的包裝情況。RT-PCR鑒定重組腺病毒的HBx基因表達(dá)。根據(jù)GFP的表達(dá)檢測病毒滴度和感染效率。將病毒感染人肝癌HepG2細(xì)胞，48 h后收集裂解細(xì)胞，Western blot檢測HBx蛋白的表達(dá)。結(jié)果:重組腺病毒載體pAd-HBx經(jīng)酶切鑒定確認(rèn)構(gòu)建成功。將pAd-HBx轉(zhuǎn)染到QBI-293A細(xì)胞，熒光檢測提示病毒獲得成功包裝，RT-PCR檢測到細(xì)胞中HBx基因的表達(dá)。重組病毒感染人肝癌HepG2細(xì)胞，Western blot檢測到HBx蛋白表達(dá)。結(jié)論:成功構(gòu)建了攜帶HBx基因的重組腺病毒，感染肝癌HepG2細(xì)胞后檢測到了HBx蛋白的表達(dá)，提示建立了HBx高表達(dá)的細(xì)胞模型，為后續(xù)的HBx的功能研究奠定了基礎(chǔ)。Military Medical Sciences，Beijing 100071

乙肝病毒x(HBx)蛋白是乙肝病毒致肝細(xì)胞癌變的重要相關(guān)分子［1］，具有多種生物學(xué)功能，可通過反式激活作用調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，與宿主細(xì)胞的多種蛋白相互作用［2］，調(diào)控宿主細(xì)胞基因表達(dá)，進(jìn)而影響宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化和細(xì)胞凋亡、蛋白降解過程及遺傳穩(wěn)定性［3-5］等。為了深入研究HBx的功能，建立HBx多種高表達(dá)的細(xì)胞模型和(或)小鼠模型，進(jìn)而研究HBx參與調(diào)控的信號(hào)通路，作者構(gòu)建了HBx的重組腺病毒載體，經(jīng)過包裝得到高滴度的HBx重組腺病毒，并用其感染肝癌HepG2細(xì)胞，檢測HBx表達(dá)，為深入研究HBx的生物學(xué)功能提供所需的材料。

1 材料與方法

1.1 材料 腺病毒載體系統(tǒng) pAdTrack、含pAdEasy-1載體的 BJ5183細(xì)菌、HepG2細(xì)胞、QBI-293A細(xì)胞以及空腺病毒均來自該教研室;含HBV1.3的pAAV-HBV1.3載體由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰教授惠贈(zèng);pMD18-T載體系統(tǒng)購自TaKaRa公司;DH5α感受態(tài)、DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker、小量質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、PacⅠ購自NEB公司;胎牛血清、高糖型DMEM培養(yǎng)液(C12430)購自Gibco公司;PMSF購自Amresco公司;HBx多克隆抗體為作者先期使用原核表達(dá)的HBx蛋白免疫大耳白兔所制備;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Western blot顯色試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

1.2 重組表達(dá)HBx腺病毒的制備

1.2.1 重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HBx載體的構(gòu)建和鑒定 設(shè)計(jì) HBx編碼基因擴(kuò)增的引物 P1:5’-AAGCTTGCCACGATGGCTGCTAGGTTG-3’，P2:5’-TTATGCAGAGGTGAAAAAGTTG-3’，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成;以pAAV-HBV1.3為模板，PCR擴(kuò)增HBx的編碼基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為474 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的基因片段，連接入pMD18-T克隆載體，在含氨芐青霉素平板上培養(yǎng)選取單克隆菌落，擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測定(由北京奧科鼎盛生物科技公司完成)，將序列正確的克隆以HindⅢ和SmaⅠ酶切，回收HBx基因片段后連接入經(jīng)HindⅢ和EcoRⅤ酶切回收的pAdTrack載體中。挑取卡那霉素選擇性培養(yǎng)基篩選的陽性克隆，提取質(zhì)粒，使用BamHⅠ進(jìn)行酶切鑒定(正確重組載體應(yīng)含有3個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)，其中一個(gè)為pAdTrack載體所含有的位點(diǎn)，另外一個(gè)為HBx編碼區(qū)N端所含有的位點(diǎn)，第3個(gè)位點(diǎn)為pMD18-T-HBx載體編碼下游T載體所含有的位點(diǎn))。正確的克隆被切開為3條帶，其中5 171 bp和3 885 bp為載體片段，468 bp為含HBx的目的片段，正確克隆命名為pAdTrack-HBx。

1.2.2 HBx重組腺病毒載體的構(gòu)建 將上述構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HBx使用PmeⅠ酶切線性化后轉(zhuǎn)化入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)菌中?？敲顾剡x擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑取10個(gè)菌落較小的克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，依據(jù)文獻(xiàn)［6］使用快速裂解法初步篩選重組克隆。選擇2個(gè)DNA條帶最大的克隆，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)擴(kuò)增質(zhì)粒，用PacⅠ酶切鑒定質(zhì)粒，切下3.0 kb或4.5 kb條帶的克隆載體，為正確重組的表達(dá)HBx腺病毒載體克隆，命名為pAd-HBx重組載體。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 QBI-293A細(xì)胞及HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清(FBS)，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃恒溫孵箱培養(yǎng)。按Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.4 pAd-HBx重組腺病毒的包裝和滴度測定pAd-HBx重組質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切后，回收大片段后轉(zhuǎn)染入QBI-293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6～8 d后，在熒光顯微鏡下監(jiān)測細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況，如果細(xì)胞中的綠色熒光充滿視野則說明重組腺病毒載體在細(xì)胞中包裝成病毒。收集包裝后的細(xì)胞，一部分加入1 mL的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，－70℃/37℃反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，離心后取含病毒的上清液－70℃保存。一部分以未包裝細(xì)胞和空腺病毒感染細(xì)胞為陰性對(duì)照，用Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以pMD18-T-HBx為陽性對(duì)照，PCR擴(kuò)增鑒定HBx的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。取重組病毒和空腺病毒上清液再次感染QBI-293A細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，經(jīng)過3次擴(kuò)增，倍比稀釋病毒上清并感染細(xì)胞，以感染細(xì)胞GFP陽性數(shù)目計(jì)算病毒滴度以及感染復(fù)數(shù)(MOI)。

1.3 重組表達(dá)HBx腺病毒在HepG2細(xì)胞中表達(dá)的Western blot檢測 接種2孔(2.5×105個(gè)/孔)HepG2細(xì)胞于6孔板中，用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)18 h，吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加新鮮培養(yǎng)基500μL，并按MOI為20的標(biāo)準(zhǔn)加入重組腺病毒(表達(dá)HBx的腺病毒和空病毒對(duì)照)，吸附1 h后，加入1.5 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，感染72 h后，熒光顯微鏡檢測含綠色熒光的腺病毒是否感染HepG2。收集細(xì)胞，冰上裂解30min，進(jìn)行SDSPAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移后的膜于封閉液中封閉，先后與前期制備的抗-HBx多克隆抗體(按1∶2 000稀釋)和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(按1∶10 000稀釋)共孵育，洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光劑ECL，在暗室中曝光，顯影，定影，在膠片上獲得相應(yīng)的條帶，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)HBx的腺病毒構(gòu)建結(jié)果

2.1.1 穿梭載體pAdTrack-HBx的構(gòu)建 HBx擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1A所示，回收PCR產(chǎn)物連接入pMD18-T載體中，鑒定連接成功后，進(jìn)行序列測定，結(jié)果與GenBank序列完全一致。HBx片段連接入pAdTrack載體中應(yīng)用BamHⅠ酶切鑒定結(jié)果如圖1B，切開大小與理論一致，證明HBx被正確連接入pAdTrack載體中，命名為pAdTrack-HBx。

2.1.2 pAdTrack-HBx與pAdEasy的同源重組 穿梭載體pAdTrack-HBx與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183感受態(tài)細(xì)菌中同源重組后的質(zhì)粒用PacⅠ酶切鑒定結(jié)果如圖1C，切下4.5 kb大小的條帶。符合腺病毒說明書穿梭質(zhì)粒與骨架載體重組后的酶切特征，說明含HBx基因的腺病毒載體pAd-HBx重組成功。

圖1 重組表達(dá)HBx腺病毒的構(gòu)建

2.1.3 重組腺病毒在QBI-293A細(xì)胞內(nèi)的包裝、擴(kuò)增和鑒定 將經(jīng)PacⅠ酶切線性化的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HBx轉(zhuǎn)染到QBI-293A細(xì)胞后第8天后，檢測到綠色熒光充滿視野中的絕大多數(shù)細(xì)胞，提示病毒已經(jīng)包裝成功。以未感染以及感染空腺病毒感染QBI-293A細(xì)胞為對(duì)照，RT-PCR結(jié)果為HBx重組腺病毒細(xì)胞組擴(kuò)增出HBx基因，而對(duì)照的未感染細(xì)胞以及空腺病毒感染細(xì)胞未擴(kuò)增出HBx基因(圖2)。

圖2 RT-PCR結(jié)果

2.2 HBx重組腺病毒在HepG2中的表達(dá) 將擴(kuò)增的HBx重組腺病毒和對(duì)照空腺病毒感染HepG2細(xì)胞72 h后熒光顯微鏡觀測細(xì)胞中GFP的表達(dá)，結(jié)果可見視野中細(xì)胞GFP的表達(dá)，說明HepG2細(xì)胞被腺病毒成功感染。Western blot方法檢測感染病毒后的2組細(xì)胞HBx蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)空載體感染細(xì)胞組不表達(dá)HBx蛋白，而HBx重組腺病毒感染細(xì)胞組表達(dá)HBx蛋白(圖3)。

圖3 HepG2細(xì)胞感染后HBx表達(dá)的Western blot檢測

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡率第二位。乙肝病毒感染是引起肝癌的主要原因之一。乙肝病毒編碼的x蛋白是一種反式作用因子，它通過增強(qiáng)各種轉(zhuǎn)錄和調(diào)控因子的表達(dá)影響肝細(xì)胞的增殖和凋亡，在原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［7］。

該研究在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了多種可能受到HBx調(diào)控表達(dá)的基因，為了從多方面驗(yàn)證HBx的過表達(dá)調(diào)節(jié)靶基因的通路，擬建立HBx的多種高表達(dá)細(xì)胞系，為此構(gòu)建了pCDNA3.1-HBx載體，然而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率不高，不能產(chǎn)生均一、高效表達(dá)HBx的細(xì)胞系。如果使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，則存在建立周期長，整合位點(diǎn)不確定，表達(dá)效率不均一等缺點(diǎn)?？紤]到腺病毒具有感染效率高，宿主廣泛，容易制備表達(dá)，不整合入染色體，表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，作者構(gòu)建了HBx重組腺病毒載體，并將構(gòu)建的病毒載體轉(zhuǎn)染后，成功組裝成表達(dá)HBx的腺病毒，使用制備的病毒感染肝細(xì)胞HepG2，熒光檢測可見細(xì)胞全部受到感染，而普通的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2效率僅能達(dá)到10%～30%。通過Western blot檢測病毒感染后的細(xì)胞裂解液，證明HBx在HepG2得以高效表達(dá)，說明作者制備的重組腺病毒可以在HepG2細(xì)胞中高效均一地表達(dá)HBx蛋白。

總之，該實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了HBx腺病毒載體，包裝得到表達(dá)HBx蛋白的腺病毒，制備的腺病毒可以高效感染HepG2細(xì)胞，高效表達(dá)HBx，為后續(xù)HBx功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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(2011-10-16收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Construction and expression of recombinant HBx-expressed adenovirus and HBx expression in HepG2

ZHANG Hongfei1，2)，LI Junfeng2)，HU Yi2)，ZHANG Huina1)，BAO Chunyang2)，WANG Kaijuan1)，ZHOU Yusen2)
1)Department of Epidemiology，College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity，Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of

adenovirus vector;HBx gene;hepatoma cell

Aim:To construct recombinant HBx-expressed adenovirus，and establish a cell culture model with highlevel HBx expression by infection.Methods:HBx gene was cloned into the shuttle vector pAdTrack.After confirmed by restriction digestion，the resultant plasmid was linearized by digestion with PmeⅠ and was subsequently transformed into competent E.coli cells BJ5183 for homologous recombination.The recombination vector pAd-HBx was linearized with PacⅠ and transfected into QBI-293A cells.The packing of adenovirus was determined by the expression of EGFP.The expression of HBx gene in recombinant adenovirus was identified by RT-PCR.Viral titer and infection efficiency of adenovirus were detected according to the expression of GFP.HepG2 cells were infected by recombinant adenovirus.Forty-eight hours later，cells were collected and lysed to detect the expression of HBx protein by Western blot.Results:Restriction digestion showed that the recombinant adenovirus vector pAd-HBx was successfully constructed.After pAd-HBx transfected into QBI-293A cells，fluorescence detection indicated that the adenovirus was successfully packed.The expression of HBx gene was detected by RT-PCR.After infection to the hepatoma HepG2 cells，the expression of HBx protein was detected by Western blot.Conclusion:The recombinant adenovirus expressing HBx gene has been successfully constructed.After infecting HepG2 cell，the HBx protein expression is detected，suggesting cell culture model with high-level expression of HBx is established.

R575.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.04.008

*國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30900753