蛋白酶體抑制劑MG-132改善大鼠心肌梗死后心肌肥厚

陳章榮，吳新華*，羅開良，何 泉，向玉鸞

(1.大理學院附屬醫(yī)院心內科，云南大理6710000;2.重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心內科，重慶410010;3.重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心內科，重慶410016)

心肌梗死后非梗死區(qū)心肌細胞肥大是心肌梗死后心肌重塑的重要特征之一，參與心衰的發(fā)生發(fā)展過程，防治病理性心肌細胞肥大對防治心肌重塑及心衰的發(fā)生發(fā)展有重要意義。近年來的研究表明，蛋白酶體系統(tǒng)的活性增加與心肌肥厚有明顯關系，應用蛋白酶體抑制劑能改善壓力負荷過重的心肌肥厚［1－2］。研究表明蛋白酶體抑制劑PS-519通過抑制NF-κB的活性，抑制炎性因子表達而減輕小鼠心肌肥厚［3］。用MG-132可以使肥大心肌細胞的體積縮小［4］。另外的研究表明蛋白酶體抑制劑MG-132通過抑制NF-κB活性，減輕炎癥因子表達而減輕減輕大鼠心肌缺血再灌注的損傷［5］。因此，推測MG-132可以通過抑制NF-κB活性改善心肌梗死后心肌肥厚，本研究對此進行探討。

1 方法

1.1 動物心肌梗死模型的建立及給藥方法

健康清潔級體質量相近的SD大鼠，雌雄各半，購于重慶醫(yī)科大學動物中心(合格證號:SCXK［渝］2007-0001)，體質量250±50 g。心肌梗死模型制作參照文獻［6］進行。胸骨左緣第2～4肋開胸，以左冠脈主干為標志，在左心耳下方2 mm處進針，6/0號絲線結扎左前降支，當結扎區(qū)域變白，心電圖多于兩個肢導聯(lián)出現(xiàn)ST段上抬至少0.2 mV，則判斷為造模成功。將造模成功且術后24 h仍存活的大鼠隨機分為MI組和MG組。另設假手術(SH)組，SH組在相同冠脈部位只穿線不結扎。每組動物均為6只。MG組于術后24 h腹腔內注射MG-132(Calbiochem公司)0.1 mg/(kg·d)［7］，連續(xù)給藥28 d，MI 組及SH組給0.9%氯化鈉注射液對照。

1.2 超聲心動圖、左室質量指數及標本采集

大鼠在處死前均行超聲心動圖(HP/SONOS 5500多普勒超聲儀，探頭頻率4～10 MHz)，測定左室后壁厚度。處死動物，摘取心臟，剔除血管組織及右心室，稱取左心室濕重，除以體質量獲得左室質量指數(mg/g)。然后沿左心室長軸分為3份，心底部及心尖部置于液氮速凍后置－70℃保存用于反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測。中間部分切成3 mm的薄片，4%多甲醛溶液固定24 h后，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。

1.3 非梗死區(qū)心肌細胞表面積、周長及平均直徑

每個標本選2張?zhí)炖切杉t染色切片，用北航CM-2000B型生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，測量天狼猩紅染色切片中心心肌細胞各種形態(tài)參數。每張切片選擇5個視野，計算機自動計算出各視野中心肌細胞形態(tài)參數值:心肌細胞面積、周長及平均直徑。

1.4 半定量RT-PCR檢測NF-κB及IL-1β表達

隨機取各組大鼠心肌組織，按Trizol法提取心肌組織總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳證實RNA的完整性后，采用紫外分光光度計測定其濃度。取2 μg總RNA，以AMV反轉錄酶(Toyobo公司，日本)合成cDNA，取反轉錄產物進行PCR反應。反轉錄反應體系為:Oligo 5 μL，總 RNA 7 μL，L.5 ×RT 緩沖液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNAase 抑制劑1 μL，ReverTraAce 1 μL。反轉錄反應條件:30 ℃10 min，42℃ 60 min，85℃ 5 min。引物由上海博尚生物公司合成，NF-κB P65:上游5'-CAGCACATC CAGACAGACACCA-3'，下游 5'-GCTGCTAAAAGAA TCCTCAAAACC-3'，產物長度480 bp;IL-1β:上游 5'-CACCTTCTTTTCCTTCATCTTTG-3'，下游 5'-AAGAC AAACCGCTTTTCCATC-3'，產物長度381 bp;β-actin:上游 5'-CAGCTTCTTCTAGTGCCGTTCC-3'，下游 5'-GGAGTCAGGTGTTTCTGGTGGAG-3'， 產 物 長 度219 bp。反應體系:滅菌蒸餾水35 μL，10×PCR 緩沖液5 μL，上 游 引 物 1.5 μL，下 游 引 物 1.5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，Taq 酶1 μL，cDNA 2 μL。NF-κB P65的PCR反應條件:94℃預變性5 min后，94 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后，72℃延伸5 min;IL-1β及β-actin的退火溫度分別為50℃、58℃，其余反應條件與NF-κB P65反應條件相同。PCR產物經含Goldview的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠成像系統(tǒng)拍照、掃描。QuantityOne4.6軟件進行圖像分析計算 NF-κB P65及IL-1β產物相對量。吸光面積積分比值表示DNA含量，以NF-κB P65及IL-1β與β-actin擴增條帶的吸光面積積分比值評定mRNA表達水平。

1.5 免疫組化檢測NF-κB、IL-1β蛋白質表達

用免疫組織化學SP法(SP試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司;兔抗大鼠 NF-κB P65 IgG、兔抗大鼠IL-1β IgG為Santa Cruz)觀察心肌細胞NF-κB P65和IL-1β蛋白表達情況。石蠟包埋切片脫蠟，梯度乙醇浸泡，PBS沖洗，5%山羊血清封閉后，兔抗大鼠NF-κB P65 IgG和兔抗大鼠IL-1β(抗體濃度1∶100)孵育4℃過夜。次日分別滴加生物素標記山羊抗兔IgG(二抗)和辣根酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木精復染，封片，拍照。高倍鏡下觀察核因子P65蛋白表達情況，半定量分析方法參照文獻［8］所述，以心肌細胞核中出現(xiàn)棕色顆粒為陽性細胞，計算陽性指數(PI)，PI=(陽性細胞數/視野內總細胞數)×100%。每片觀察5個非重疊高倍視野，取平均值。IL-1β以心肌細胞胞質出現(xiàn)現(xiàn)棕色顆粒為陽性細胞，每片隨機觀察5個非重疊高倍視野，用計算機圖像分析系統(tǒng)(Image proplus 5.1，Media Cybernetics，USA)計算積分吸光度值(IA)作為半定量參數。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有資料采用SPSS12.0軟件統(tǒng)計包進行分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩組之間的比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 左室后壁厚度、左室質量指數

與SH組比較，MI組和MG組左室后壁厚度、左室質量指數增加(P＜0.01)，而MG組大鼠的上述指標均得到明顯改善(P＜0.01)(表1)。

表1 各組的左室后壁厚度、左室質量指數Table 1 The values of left ventricle posterior wall thickness and left weight index in all groups(x ± s，n=6)

2.2 非梗死區(qū)心肌細胞形態(tài)學參數

與SH組比較，MI組和MG組心肌細胞表面積、周長、平均直徑顯著增加 (P＜0.01)，而MG組大鼠的上述指標均得到明顯改善 (P＜0.01)(圖1，表2)。

2.3 NF-κB和IL-1β的mRNA表達

與SH 組相比，MI組和 MG 組 NF-κB、IL-1β 的mRNA表達量明顯增加(P＜0.01)，與MI組相比，MG組的mRNA表達明顯降低(P＜0.01)(圖2，表3)。

圖1 各組的細胞表面積、周長及直徑Fig 1 The myocardial cell surface area，perimeter and direct in all groups(×200)

表2 各組的細胞表面積、周長、直徑Table 2 The myocardial cell surface area，perimeter and direct in all groups(x ± s，n=6)

圖2 大鼠心肌NF-κB、IL-1β的RT-PCR結果Fig 2 The mRNA levels of NF-kappaB P65 and IL-1β in all groups

表3 NF-κB、IL-1β的 mRNA 表達量Table 3 The mRNA levels of NF-kappaB P65 and IL-1β in all groups(x ± s，n=6)

2.4 NF-κB、IL-1β的蛋白質表達

結果見，MI組和MG組NF-κB、IL-1β的蛋白質表達量相對于SH組明顯增加(P＜0.01)，MG組與MI組相比，其蛋白質表達量明顯降低(P＜0.01)(圖3，表 4)。

3 討論

圖3 免疫組化法檢測NF-κB和IL-1β蛋白質表達Fig 3 The myocardial cell surface area，perimeter and direct in all groups(×200)

表4 NF-κB、IL-1β的蛋白質表達量Table 4 The protein levels of NF-kappaB P65 and IL-1βin all groups(x ± s，n=6)

泛素－蛋白酶體系統(tǒng)在心肌細胞的生長、發(fā)育中扮演重要角色［9］，其功能失調與心肌缺血、肥厚、纖維化以及心肌細胞凋亡有關［10］。心肌肥厚模型中心內膜下心肌的蛋白酶體亞基表達增加，活性增強，應用蛋白酶體抑制劑改善心肌肥厚成為可能［1］。體外實驗表明應用MG-132可以使肥大心肌細胞的體積縮?。?］，體內實驗表明，MG-132可改善壓力負荷過重導致的心肌肥厚［2］。然而，尚未見MG-132改善心肌梗死后心肌肥厚的研究報道，鑒于此，本研究進行探討。

本研究制作大鼠心肌梗死模型，測量左室后壁厚度及計算左室質量指數，計算非梗死區(qū)的心肌細胞的形態(tài)學參數如心肌細胞的直徑、周長和表面積。結果顯示MI組的上述指標較sham組增加，說明心肌梗死后發(fā)生了非梗死區(qū)肥厚。而MG組的上述指標較MI組明顯降低，說明MG-132干預能改善梗死后非梗死區(qū)的心肌肥厚。心肌梗死后心肌處于缺血狀態(tài)，出現(xiàn)大量損傷蛋白，泛素蛋白酶體活性代償性增加。當泛素蛋白酶體的活性過高時，一方面促進心肌肥厚抑制物如環(huán)磷酸腺苷受體降解，導致心肌肥厚［9］;另一方面，泛素蛋白酶體活性過高促進NF-κB激活，NF-κB 激活與心肌肥厚有密切關系［11］。蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體活性，能減輕心肌肥厚［1］。本研究的結果表明，小劑量MG-132可以改善心肌梗死大鼠非梗死區(qū)的心肌肥厚。

本研究在基因和蛋白質水平對NF-κB、IL-1β在心肌細胞中的表達進行檢測。結果顯示MI組的NF-κB蛋白質和mRNA表達增加，證明NF-κB在心肌梗死后存在持續(xù)激活，最近的研究也證明了心肌梗死后存在 NF-κB 的激活［12］。激活的 NF-κB 通過增加炎性細胞因子的表達，這些因子通過一系列的信號通路參與心肌細胞肥大過程。本研究中，MI組的IL-1β在基因和蛋白質水平呈現(xiàn)高表達，說明了心肌梗死后心肌肥厚過程中存在炎性細胞因子的表達增加，這與文獻［13］報道相符。IL-1β可通過活化C-JUN氨基端激酶/應激活化蛋白激酶以及促分裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應信號通路導致心肌肥厚［14］，使用 MG-132后 NF-κB 及其下游的炎性細胞因子(如IL-1β)降低，IL-1β的表達與NF-κB成一致變化，證實MG-132通過抑制NF-κB激活，降低炎性細胞因子如IL-1β的表達水平使非梗死區(qū)心肌肥厚得到改善。

雖然本實驗證實了MG-132能改善大鼠心肌梗死后心肌肥厚，為心肌梗死的治療提供了一種新的思路和方法。然而，由于心肌肥厚的機制較為復雜，MG-132是否通過其他機制改善心肌肥厚以及其抑制NF-κB激活的具體機制尚有待進一步的研究。

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