初發(fā)性類風濕關節(jié)炎患者外周血中Tfh細胞及其相關細胞因子的臨床意義

徐 琦，程路峰，孟 巖，付 偉，楊 昭，丁劍冰*，羅 莉*

(新疆醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學院;2.公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學博士后流動站;3.第一附屬醫(yī)院風濕科，新疆烏魯木齊830011)

濾泡輔助性T細胞(T follicular helper cells，Tfh細胞)是近年來新發(fā)現(xiàn)的，真正意義上輔助B細胞功能的T細胞亞群，其輔助B細胞活化、增殖、分化和分泌免疫球蛋白［1］。在類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)中，B細胞分泌大量高親和力抗體可誘發(fā)炎性反應，致關節(jié)損傷［2］。本實驗擬通過對RA患者外周血Tfh細胞表型及相關細胞因子的檢測，探討其與初發(fā)性RA發(fā)病的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象及主要試劑

1.1.1 研究對象:RA組:新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕科初次就診患者，符合1987年美國風濕病學會(ACR)RA診斷標準。對照組:為健康志愿者。各組均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑:FITC標記的抗CXCR5，CD3抗體;PE標記的抗CD8、CD3抗體;PerCP標記的抗CD4抗體、PE-cy7標記的抗 ICOS抗體以及同型對照(Becton Dickinson公司)。ELISA試劑盒(R＆D公司)。

1.2 免疫熒光標記和流式細胞術檢測:抗凝外周血100 μL，分別加入FITC標記的抗CXCR5，PE標記的抗CD3，PerCP標記的抗CD4，PE-cy7標記的抗 ICOS抗體各20 μL或者 FITC標記的CD3，PE標記的 CD8和PerCP標記的 CD4抗體各20 μL，按規(guī)程操作。分析Th/Tc細胞，先以CD3+細胞設門分群后，分析CD4+、CD8+細胞百分率(圖1)。Tfh細胞分析，以FSC/SSC設門，得到CD3+CD4+細胞，進而分析ICOS和CXCR5的表達(圖2)。

1.3 血清學指標檢測:按照ELISA試劑盒操作步驟檢測，酶標儀檢測450 nm處的吸光度(A)值。

1.4 統(tǒng)計學分析:數據采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件處理。數據以均數±標準差(±s)表示，根據方差齊性檢驗結果，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，不同指標之間進行Spearman相關分析。

2 結果

2.1 RA組和對照組Th/Tc細胞、CD3+CD4+CXCR5+ICOS+T細胞百分率比較:RA組CD3+CD4+T細胞百分率與對照組無顯著性差異，但 RA組 Th/Tc的比值低于對照組(P＜0.05)。RA患者CD3+CD4+CXCR5+Tfh的數量與正常對照相比較明顯增多(P＜0.05)(表1);CD3+CD4+ICOS+T細胞數量在患有RA后未見明顯增加，但CD3+CD4+ICOS+CXCR5+T細胞的數量顯著增加。

2.2 細胞因子水平的比較:RA組IL-21和TGF-β水平分別為512.80±79.83 ng/L和659.13±184.20 ng/L，顯著高于對照組的340.24±45.05 ng/L和401.17±139.64 ng/L(P＜0.01);IL-4水平由對照組的680±76.83 ng/L降至RA組的320±56.83 ng/L(P＜0.01)。

表1 RA組和對照組T細胞亞群的比較Table 1 Comparison of T cell subset between control and RA group

2.3 RA患者外周血Tfh及細胞因子與臨床指標相關性分析:RA患者Tfh細胞百分率、IL-21水平與疾病DAS28評分、ESR、CRP、CCP 和 RF 正相關(r分別為 0.67，0.49，0.38，0.21和0.59，P＜0.05)，與疾病的病程及關節(jié)腫脹指數無相關性。RA患者TGF-β水平升高而IL-4水平降低，但兩者與疾病活動度均無相關性。

3 討論

RA患者存在細胞/體液免疫功能的紊亂，活化Th1細胞釋放的細胞因子如IL-2等可以促進CD8+Tc細胞的增殖，使臨床RA患者外周血中CD3+CD4+/CD3+CD8+T細胞比例失衡，從而導致炎性反應。同時，由于Th2細胞功能的抑制，導致血清中IL-4水平的降低，對IL-21促進B細胞分化產生抗體拮抗作用的減弱會進一步加重炎性反應。另外，由于Tfh細胞的比例增加，可促進IL-21的產生，并刺激B細胞活化，加之TGF-β的協(xié)同作用，可能導致了機體分泌病理性自身抗體，從而誘發(fā)炎性反應。由于IL-21還可以來源于的Th17，因此IL-21的升高，還應考慮Th17的作用［3］。本研究僅分析RA患者外周血中Tfh細胞和IL-21的水平，并沒有對RA患者體內Tfh細胞進行分離培養(yǎng)，檢測其分泌IL-21的能力。因此對RA患者體內T細胞亞群的失調及相關細胞因子參與免疫調節(jié)功能的機制還有待進一步研究。

［1］Ma CS，Deenick EK，Batten M，et al．The origins，function，and regulation of T follicular helper cells［J］．J Exp Med，2012，209:1241－1253．

［2］Leandro MJ，Becerra-Fernandez E．B-cell therapies in established rheumatoid arthritis［J］．Best Pract Res Clin Rheumatol．2011，25:535 －548．

［3］Lina C，Conghua W，Nan L，et al．Combined treatment of etanercept and MTX reverses Th1/Th2，Th17/Treg imbalance in patients with rheumatoid arthritis［J］．J Clin Immunol，2011，31:596 －605．