紫外光照下高鐵肌紅蛋白的還原

安良梅曹洪玉,2唐 乾鄭學(xué)仿＊,,2

(1大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622)

(2遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連大學(xué)，大連 116622)

紫外光照下高鐵肌紅蛋白的還原

安良梅1曹洪玉1,2唐 乾1鄭學(xué)仿＊,1,2

(1大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622)

(2遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連大學(xué)，大連 116622)

實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)紫外波段光源照射高鐵肌紅蛋白(metmyoglobin，metMb)時(shí)，能發(fā)生與添加化學(xué)還原劑還原metMb相似的過(guò)程，本文采用紫外可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)，圓二色光譜(CD)研究了metMb在特定紫外光源下的還原過(guò)程。580 nm和544 nm處還原峰的面積變化顯示，metMb在光照時(shí)能被還原至MbFe（Ⅱ）H2O狀態(tài)，且不同的光源、特定紫外定波長(zhǎng)、溫度、pH以及不同氣體存在等條件下metMb的還原程度不同。在溫度為10℃，偏堿性條件時(shí)，定波長(zhǎng)254 nm照射有利于metMb還原；氣體存在時(shí)，由于氣體小分子與血紅素鐵的配位能力不同，不同氣體對(duì)光照metMb還原的催化作用程度也有差異，CO和O2的存在對(duì)此過(guò)程有催化促進(jìn)作用，這一結(jié)論在醫(yī)學(xué)和生理學(xué)上有重要的意義。

高鐵肌紅蛋白；紫外光照射；光照還原；紫外可見(jiàn)吸收光譜；氣體小分子

0 引 言

血紅素蛋白在生物體內(nèi)具有很多重要的功能，如儲(chǔ)存和運(yùn)輸O2、電子轉(zhuǎn)移、生物催化劑和小分子生物感應(yīng)器(O2,NO和CO)等[1-2]。肌紅蛋白(myoglobin,Mb)是研究蛋白質(zhì)結(jié)合動(dòng)力學(xué)[3]和分子構(gòu)象改變[4]的模型蛋白，由一條多肽鏈和一個(gè)血紅素輔基構(gòu)成，在體內(nèi)與O2分子結(jié)合起著儲(chǔ)存和促進(jìn)氧在細(xì)胞中擴(kuò)散的作用；它還能與CO和NO[5]等小分子配體可逆結(jié)合，從而調(diào)控其它蛋白的生理功能。Mb活性中心的血紅素Fe(Fe2+或Fe3+狀態(tài))有6個(gè)配位軌道，其中4個(gè)與卟啉環(huán)的N原子相連，第五配位與近端His 93殘基的咪唑氮結(jié)合[6],第六配位空置(deoxyMb)或與小分子配體結(jié)合。血紅素內(nèi)Fe呈Fe2+狀態(tài)時(shí)可以與小分子配體如O2和CO結(jié)合形成MbO2和MbCO，呈Fe3+狀態(tài)時(shí)可以與水分子配體結(jié)合形成metMb。遠(yuǎn)端His 64是O2或其他小分子配體進(jìn)入血紅素疏水空穴的通道，MbO2中的 O2和 metMb的H2O分子通過(guò)氫鍵與His 64的N緊密連接[7-8]。

目前國(guó)內(nèi)外多是在極端低溫條件下利用X-射線或外加光敏劑照射metMb晶體，研究其光還原過(guò)程[9-10]。在超低溫時(shí)抹香鯨的metMb被X-射線還原能產(chǎn)生Fe(II)低自旋肌紅蛋白中間態(tài)[9,11-12]。此中間亞穩(wěn)態(tài)仍然結(jié)合一水分子，但是卟啉環(huán)的鐵由三價(jià)高自旋態(tài)變成了二價(jià)低自旋態(tài)，中間態(tài)MbFe(II)H2O通過(guò)水分子的氫鍵與遠(yuǎn)端His 64穩(wěn)固連接。X射線照射還原的MbFe（Ⅱ）H2O在低于140 K時(shí)為亞穩(wěn)態(tài);溫度升高時(shí),水分子解離，變成高自旋的deoxyMb[13]，近端His 93距離鐵平面縮短了0.015 nm，鐵平面的位置變換有利于H2O解離[14]，同時(shí)珠蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，此發(fā)現(xiàn)具有重要的醫(yī)學(xué)和生理學(xué)意義。

上述研究metMb的還原過(guò)程多在超低溫晶體條件下，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在普通光照條件下，就能把metMb還原到二價(jià)狀態(tài)，其紫外光照還原機(jī)理為光誘導(dǎo)的分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移[15]，本文進(jìn)一步研究此還原過(guò)程，運(yùn)用紫外可見(jiàn)光譜、紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜、圓二色光譜等方法，通過(guò)研究光照后Q帶還原峰面積的變化，探討metMb溶液在常溫下的光照還原機(jī)制及其對(duì)不同外界因素的依賴性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

將馬心肌紅蛋白(metMb)樣品(美國(guó)Sigma公司)，溶解于 0.05 mol·L-1的 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖體系(pH=6.0，7.4，8.0)中，制備成濃度為 1×10-5mol·L-1的蛋白溶液，冷凍避光保存。還原劑為0.1 mol·L-1連二亞硫酸鈉溶液，氧化劑為0.1 mol·L-1的鐵氰化鉀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

metMb溶液純度的鑒定[15]：向馬心肌紅蛋白樣品中加入過(guò)量0.1 mol·L-1氧化劑鐵氰化鉀(最終濃度比為1∶100時(shí))，經(jīng)過(guò)柱層析后測(cè)得紫外吸收光譜發(fā)現(xiàn)，樣品的吸收帶形狀幾乎沒(méi)有變化，所以購(gòu)買的馬心肌紅蛋白幾乎全部是高鐵肌紅蛋白(metMb)。

（ⅰ） 光源：取3 mL pH=7.4的metMb溶液置于5 mL離心管中，將樣品置于冰上，保持溫度恒定，分別在正午陽(yáng)光、日光燈、紫外殺菌燈3種光源下照射2 h；對(duì)照樣不做其他任何處理。

（ⅱ） 定波長(zhǎng)：取3 mL pH=7.4的metMb溶液置于熒光比色皿中，在FP-6500型熒光光譜儀中分別使用254、280、409和430 nm 4種波長(zhǎng)在 20℃下照射蛋白樣品2 h；

（ⅲ） 溫度：取3 mL pH=7.4的metMb溶液置于熒光比色皿中，置于FP-6500型熒光光譜儀中使用254 nm波長(zhǎng)照射2 h，照射時(shí)的溫度分別設(shè)為4、10、25和35℃；

（ⅳ） pH：分別取 3 mL pH為 6.0、7.4 和 8.0 的metMb溶液，置于熒光比色皿中，置于FP-6500型熒光光譜儀中使用254 nm波長(zhǎng)在10℃下照射2 h；

利用露點(diǎn)控制和氣候補(bǔ)償技術(shù)，該系統(tǒng)還實(shí)現(xiàn)了利用地板輻射制冷的功能。通過(guò)溫濕度傳感器采集當(dāng)前室內(nèi)的溫度和濕度，中央控制器計(jì)算出當(dāng)前的露點(diǎn)溫度，通過(guò)調(diào)節(jié)混水閥控制地暖的供水溫度使水溫一直在露點(diǎn)溫度以上，保證室內(nèi)不會(huì)結(jié)露，通過(guò)風(fēng)盤除濕來(lái)保證室內(nèi)濕度恒定。

（ⅴ） 氣體：取 3 mL pH=7.4的 metMb溶液，控溫在10℃置于FP-6500型熒光光譜儀中使用254 nm波長(zhǎng)照射2 h，照射的同時(shí)分別通入恒定的氣體流(分別為 O2、N2和 CO)。

1.2.2 光譜測(cè)定

紫外可見(jiàn)光譜測(cè)定：狹縫寬度2 nm，掃描波長(zhǎng)范圍為 220～750 nm，掃描速度 200 nm·min-1，響應(yīng)時(shí)間為中等，掃描3次。

圓二色光譜測(cè)定：帶寬為4 nm，掃描波長(zhǎng)范圍為250～190 nm，靈敏度為標(biāo)準(zhǔn)，掃描速度50 nm·min-1，響應(yīng)時(shí)間 2 s，掃描 3 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 metMb化學(xué)還原與光照還原比較

metMb的三價(jià)鐵結(jié)合水的吸收峰在409、502和630 nm左右，而肌紅蛋白二價(jià)鐵結(jié)合態(tài)在波長(zhǎng)420、540和580 nm左右處有最大吸收峰，二價(jià)鐵離子還原態(tài)的最大吸收峰在430和560 nm左右[16]。metMb溶液在409 nm(Soret帶)處吸收強(qiáng)度最大，加入連二亞硫酸鈉 (與metMb的物質(zhì)的量濃度比為5∶1)時(shí)，metMb在409 nm處吸光度降低并紅移，在Q吸收帶544 nm和580 nm處出現(xiàn)新吸收峰；當(dāng)二者濃度比達(dá)到10∶1時(shí)，Soret吸收帶紅移到430 nm，而544 nm和580 nm的兩個(gè)峰逐漸合成一個(gè)在552 nm的大吸收峰；繼續(xù)增加連二亞硫酸鈉的濃度，Soret帶和Q帶吸收峰位置和強(qiáng)度均變化不大。由此可知連二亞硫酸鈉還原metMb的過(guò)程是分三個(gè)不同階段：MbFe（Ⅲ）H2O(a 態(tài))?MbFe（Ⅱ）H2O(b 態(tài))?MbFe（Ⅱ）(c，d態(tài))，如圖1所示。這與文獻(xiàn)報(bào)道的在超低溫晶體狀態(tài)時(shí)，X-射線晶體衍射實(shí)驗(yàn)將高鐵肌紅蛋白還原，并得到穩(wěn)定的結(jié)合水的中間態(tài)[12]，溫度升高后中間態(tài)會(huì)失去水變成二價(jià)鐵還原態(tài)[13]的結(jié)論一致。

我們?cè)诔Ｒ?jiàn)條件下光照還原metMb時(shí)，發(fā)現(xiàn)與上述過(guò)程類似的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)metMb溶液進(jìn)行不同光照時(shí)間處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)光還原可使metMb達(dá)到二價(jià)結(jié)合水的狀態(tài)，即MbFe（Ⅲ）H2O(a態(tài))?MbFe（Ⅱ）H2O(b態(tài))，如圖2所示。光照還原metMb的機(jī)理[15]為光誘導(dǎo)的分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，這是由于在光照過(guò)程中，metMb的輔基鐵卟啉環(huán)受激發(fā)后發(fā)生了電子躍遷，在409 nm左右a1u(π)-eg(π*)電子躍遷產(chǎn)生的Soret帶可歸屬為π-π*躍遷產(chǎn)生的第二電子激發(fā)態(tài) S2[18]；在 500～650 nm 區(qū)間由 a2u(π)-eg(π*)電子躍遷產(chǎn)生的4個(gè)Q帶歸屬于π-π*躍遷產(chǎn)生的第一電子激發(fā)態(tài)S1，還有金屬Fe離子也可以占有d軌道，出現(xiàn)d-d躍遷[20]，這些光誘導(dǎo)的軌道躍遷屬于分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移躍遷。

2.2 不同條件下光照還原metMb 2.2.1 光源不同

從紫外可見(jiàn)吸收光譜(圖3A)和紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜(圖3B)可見(jiàn)各吸收峰強(qiáng)度的變化情況：未經(jīng)光照射處理的樣品，在Q吸收帶503 nm和630 nm處光吸收強(qiáng)度最大；日光燈照射的樣品與未經(jīng)光照射處理的樣品相比，基本沒(méi)有變化；陽(yáng)光和紫外燈照射的樣品光譜在503 nm和630 nm處吸收峰強(qiáng)度減小，544 nm和580 nm處吸收峰強(qiáng)度明顯增大，并且紫外燈照射引起的光吸收強(qiáng)度變化最大。

因此在相同的照射時(shí)間下，metMb被還原的程度趨勢(shì)為：在紫外燈下還原程度最大；陽(yáng)光相對(duì)紫外燈光源，紫外線強(qiáng)度低，引起metMb被還原的程度減?。欢展鉄舻牟ㄩL(zhǎng)范圍基本在可見(jiàn)光范圍，即400 nm到750 nm，不能激發(fā)蛋白以提供還原所需的電子，相應(yīng)的紫外吸收光譜基本沒(méi)有變化。由此可見(jiàn)是紫外波段光的光源引起metMb部分還原。

2.2.2 不同定紫外波長(zhǎng)下metMb光照還原

為進(jìn)一步考察紫外波段光源照射metMb還原情況，我們選用FP-6500型熒光光譜儀上氙燈的不同定波長(zhǎng)來(lái)光照metMb。

metMb樣品在不同定波長(zhǎng)(254,280,409和430 nm)氙燈光照后Soret帶409 nm處峰強(qiáng)度降低并輕微的紅移，在Q帶503 nm和630 nm處峰吸收強(qiáng)度降低，544 nm和580 nm處峰吸收強(qiáng)度增強(qiáng)(圖4A)；544 nm和580 nm處峰面積在隨著光照時(shí)間增加不斷增大 (圖4B、C)。當(dāng)使用不同定波長(zhǎng)的光照射蛋白時(shí)，Q帶的峰的面積變化也不相同，其中254 nm光照射時(shí)544 nm和580 nm峰的面積增加的趨勢(shì)最大，即還原產(chǎn)物MbFe（Ⅱ）H2O較多。

由此可見(jiàn)，紫外光能量越高，metMb更易被還原。在近紫外光區(qū)(200～400 nm)周圍波段光源易于其還原，可能與蛋白含芳香族氨基酸 (如Tyr或Trp)有關(guān)，芳香族氨基酸殘基可作為電子供體引導(dǎo)還原反應(yīng)[21]。

2.2.3 不同溫度下metMb紫外光照還原

從圖5可以看出，metMb在580 nm和544 nm處峰面積隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。在溫度為4℃或10℃時(shí)，光照后的蛋白在580 nm和544 nm處的峰面積增加較大。溫度為35℃時(shí)峰面積變化最小，光照40 min后峰面積增加平緩。圖5說(shuō)明溶液狀態(tài)下低溫有利于metMb的還原，即在光還原MbFe（Ⅲ）H2O→MbFe（Ⅱ）H2O過(guò)程中，溫度越低，metMb被光照還原的能力越強(qiáng)。

2.2.4 不同pH 下metMb光照還原

肌紅蛋白溶液在酸性條件下為單體，在pH達(dá)到9時(shí)溶液中氫氧根的濃度足夠大，從而取代了原來(lái)血紅素中第六配位的水進(jìn)行配位[22]，紫外圖譜中在586 nm處已經(jīng)形成一個(gè)新峰，pH＞9時(shí)肌紅蛋白還易形成二聚體，酸性條件下蛋白易變性，為此我們考察了 pH為 6.0、7.4、8.0 的高鐵肌紅蛋白緩沖溶液的光照情況。在3個(gè)pH值下，metMb在Soret帶(表1)和Q帶(圖6A)的吸收強(qiáng)度基本不變。在溫度10℃下，使用氙燈254 nm單色光分別照射3種不同pH值下的metMb溶液，其580 nm和544 nm處峰面積隨照射時(shí)間變化的譜圖如圖6B、C。在光照處理前后，pH為8.0時(shí)兩處峰面積均比pH為7.4 或 6.0 時(shí)面積大；pH為 6.0 的樣品在光照的前90 min，兩處峰面積均有所增加，90 min后基本不再變化；而pH為7.4和8.0樣品兩處峰面積均隨著光照時(shí)間的增加而增大，說(shuō)明偏堿性條件有利于metMb的光照還原。

表1 在溫度為10℃，254 nm光照不同pH的metMb，對(duì)Soret帶的影響Table 1 Effects of Soret band at 10℃,254 nm Irradiation under different pH values of metMb

光照metMb在不同pH時(shí)對(duì)Soret帶的影響如表1所示，隨著pH的增加，光照影響Soret帶的吸收強(qiáng)度變化由0.1591升高到0.2153，并且其在光照后Soret帶發(fā)生紅移，堿性條件下紅移更大。metMb在偏堿性條件下易于被光照還原，可能與metMb在不同pH時(shí)的結(jié)合態(tài)有關(guān)。在偏堿性時(shí)易于形成穩(wěn)定的高自旋三價(jià)結(jié)合水態(tài)；在酸性條件下，高鐵肌紅蛋白的組氨酸殘基發(fā)生質(zhì)子化，轉(zhuǎn)移氫鍵，三價(jià)結(jié)合水態(tài)較不穩(wěn)定[23]。

2.2.5 通入氣體對(duì)光照metMb還原的影響

CO，O2分子都可以與還原態(tài)肌紅蛋白[24]結(jié)合，不與高鐵肌紅蛋白結(jié)合，圖7是不同氣體存在條件下光照引起高鐵肌紅蛋白還原的結(jié)果。光照條件下有無(wú)氣體都能引起metMb的還原，但在有氣體特別是CO和O2時(shí)，更有利于蛋白還原。在540 nm、579 nm出現(xiàn)MbCO(e)的特征吸收峰，證明metMb被還原后立刻與通入的CO結(jié)合；544 nm和581 nm處峰顯示N2存在時(shí)metMb轉(zhuǎn)化率較低，相比較O2存在時(shí)metMb光照下被還原轉(zhuǎn)化率則較高。O2存在下光照的樣品(c)與沒(méi)有外加氣體僅光照2 h的蛋白樣品(b)紫外光譜圖基本相似，說(shuō)明空氣中氧氣量足以催化metMb還原。這可能是由于氣體與Fe2+的配位能力CO＞O2＞H2O＞N2，根據(jù)配位能力氣體對(duì)光照還原的metMb催化促進(jìn)作用也不同；與H2O相比CO、O2能更好的與Fe2+結(jié)合，使光還原MbFe（Ⅱ）H2O→ MbFe（Ⅲ）H2O更易于向正反應(yīng)方向進(jìn)行，CO、O2對(duì)光照還原metMb有正催化促進(jìn)能力。這是由于metMb在光照后卟啉環(huán)上的電子受激發(fā)，發(fā)生了ππ*電子躍遷，電子從卟啉環(huán)轉(zhuǎn)移到中心鐵原子，使得三價(jià)鐵得到一個(gè)電子變?yōu)槎r(jià)鐵，當(dāng)有CO存在時(shí)更能穩(wěn)定的結(jié)合到還原的二價(jià)鐵上，使還原后的蛋白形成穩(wěn)定的MbCO[21]。其反應(yīng)式如下：

2.3 不同氣體存在時(shí)metMb光照還原的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)不同，其活性生色基團(tuán)的光學(xué)活性也不同，圓二色性將呈現(xiàn)較大的差異。根據(jù)所測(cè)得蛋白遠(yuǎn)紫外CD譜，能反映出蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息[25-26]。

光照時(shí)不同氣體的通入引起metMb二級(jí)結(jié)構(gòu)變化是不同的。如圖8 CD圖譜所示通入O2或在空氣中光照2 h的蛋白樣品與通入N2時(shí)明顯不同，N2存在時(shí)metMb還原率明顯降低，這與圖7紫外光譜圖結(jié)論一致。通過(guò)圓二色光譜二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件算出，光照還原后蛋白α-螺旋含量由光照前的64.9%下降到 56.6%，CO、O2存在時(shí) α-螺旋含量下降最大，分別下降9.3%和8.7%，而N2存在時(shí)α-螺旋含量反而增加1.8%；β-折疊含量增加，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量變化不大。

由以上結(jié)果說(shuō)明，溶液中的溶解氧分子對(duì)光照還原metMb有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)溶液中充滿N2時(shí)其還原的效率降低；而metMb經(jīng)光照后，在CO氣體存在時(shí)更容易被還原，且還原后的蛋白較快的與CO氣體結(jié)合，形成與CO的復(fù)合物MbCO。

3 結(jié) 論

本文采用紫外光源對(duì)metMb緩沖溶液進(jìn)行光照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，其在定波長(zhǎng)(254 nm)的氙燈光源光照過(guò)程中，紫外可見(jiàn)光譜中Soret吸收帶409 nm處吸收強(qiáng)度下降并輕微紅移，同時(shí)在Q帶580 nm和544 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，且吸收峰面積隨著光照時(shí)間不斷增加。metMb光照后可被還原成Fe（Ⅱ）的中間亞穩(wěn)態(tài)，通過(guò)比較Q吸收帶580 nm和544 nm處吸收峰面積的變化，在紫外光源的照射下，波長(zhǎng)、溫度、pH以及氣體等外界因素對(duì)高鐵肌紅蛋白的還原均有影響。metMb在定波長(zhǎng)254 nm照射，溫度為10℃，偏堿性的適宜條件下，對(duì)其光還原較有利。根據(jù)氣體小分子與血紅素鐵的配位能力不同，可不同程度的催化metMb的還原過(guò)程，氣體對(duì)metMb光照還原有催化作用與Fe2+和氣體配位能力有關(guān)。通過(guò)圓二色光譜表明不同氣體存在時(shí)光照metMb，其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化也有相應(yīng)變化。紫外光照高鐵肌紅蛋白的還原過(guò)程以及氣體小分子與Fe（Ⅱ）配位催化還原過(guò)程在醫(yī)學(xué)和生理學(xué)上具有重要意義。

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Photoreduction of Metmyoglobin by Ultraviolet Irradiation

AN Liang-Mei1CAO Hong-Yu1,2TANG Qian1ZHENG Xue-Fang＊,1,2
(1College of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)
(2Liaoning Key Laboratory of Bio-organic Chemistry,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)

According to the experiment,we have discovered that the photoreduction procedure of metMb is similar to the chemical reduction course.In this research,the photoreduction induced by direct irradiation in the ultraviolet region was investigated by means of UV-Vis absorption and circular dichroism (CD)spectra.By comparing the changes of new absorption peak area at 580 and 544 nm of the Q band,we observed the reduction extent under different light sources,specific UV fixed wavelengths,temperature,pH values and gas exposure;metMb is reduced to MbFe（Ⅱ）H2O state after the illumination;the alkaline conditions are favored for reduction at 10℃in 254 nm wavelength UV;as the coordination abilities of heme iron with gas molecules differ,the catalytic process of reduction varies under UV irradiation in the presence of gas.CO or O2can facilitate the photoreduction process.These conclusions have a promised significance in medicine and physiology.

metmyoglobin;UV irradiation;photoreduction;UV-Vis absorption spectra;gas molecules

O629.73；O644.1

A

1001-4861(2012)07-1461-08

2011-11-28。收修改稿日期：2012-03-22。

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.20871024)；遼寧省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(No.2006T002，2008T005，2009T003)；遼寧省教育廳(No.2009A069，2009A071)和大連市科技計(jì)劃(No.2008E11SF170)資助項(xiàng)目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：dlxfzheng@126.com，Tel：+86-0411-87403720