載藥脂質(zhì)體復(fù)合缺鈣磷灰石骨水泥支架的研究

梁 偉徐 建葛淑華杜俊杰楊 敏閆 銘羅卓荊＊,蘇佳燦劉昌勝

(1第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院骨科，西安 710199)

(2上海市第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院骨科，上海 200433)

(3華東理工大學(xué)教育部醫(yī)用生物材料研究中心，上海 200237)

載藥脂質(zhì)體復(fù)合缺鈣磷灰石骨水泥支架的研究

梁 偉1徐 建1葛淑華1杜俊杰1楊 敏1閆 銘1羅卓荊＊,1蘇佳燦2劉昌勝3

(1第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院骨科，西安 710199)

(2上海市第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院骨科，上海 200433)

(3華東理工大學(xué)教育部醫(yī)用生物材料研究中心，上海 200237)

采用食鹽顆粒浸出法制備了缺鈣磷灰石水泥(CPC)多孔支架；用脂質(zhì)體包裹鹽酸萬古霉素制備了載藥脂質(zhì)體。將它們兩者結(jié)合，制備了脂質(zhì)體載藥復(fù)合缺鈣磷灰石水泥(dl-CPC)支架。結(jié)果表明：缺鈣CPC多孔支架能夠?qū)⑤d藥脂質(zhì)體吸附在其大孔表面或微孔里；dl-CPC支架對MC3T3-E1細胞的生長沒有負(fù)面影響，顯示出良好的細胞相容性。此外，dl-CPC支架具有很好的抗菌性能，能夠抑制大腸桿菌生長，抗菌率達99%(12 h)。dl-CPC支架浸泡在磷酸緩沖溶液中，釋放藥物的速度比較緩慢(前4周)；而直接吸附藥物的CPC支架，在1周內(nèi)大部分藥物釋放出來，出現(xiàn)暴釋現(xiàn)象。另結(jié)果表明：dl-CPC支架具有緩釋藥物和骨再生的雙重功能，可用于骨缺損的修復(fù)及治療慢性骨髓炎。

磷灰石水泥支架；藥物載體；脂質(zhì)體；抗菌性；藥物釋放

0 引 言

一般來說，磷酸鈣骨水泥(CPC)是由等物質(zhì)的量的磷酸四鈣(TECP)和無水磷酸氫鈣(DCPA)通過水化反應(yīng)生成羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2,)，鈣磷物質(zhì)的量比nCa/nP=1.67[1-3]。對于類羥基磷灰石結(jié)構(gòu)的磷酸鈣鹽，nCa/nP越低，材料溶解性越高，材料植入體內(nèi)的降解性就越好[4-6]。調(diào)整TECP和DCPA的物質(zhì)的量比，通過磷酸鈣水泥的水化反應(yīng)可以生成nCa/nP低于1.67的類羥基磷灰石，從而提高CPC的降解性[7-9]。因此，本研究將調(diào)整CPC的nCa/nP，同時加入致孔劑，使其在模擬生理環(huán)境和溫度下自行硬化，并最終轉(zhuǎn)化為降解性優(yōu)良的多孔類羥基磷灰石。

將抗生素等藥物引入生物材料中，使材料在修復(fù)骨缺損的同時，緩慢釋放藥物，賦予植入材料兼具骨修復(fù)和藥物治療的雙重功能，具有重要的臨床應(yīng)用價值[10-12]。將藥物與CPC骨水泥粉末均勻混合后，再用固化液固化，藥物分散在固化體中[13]。但這種方法有一定的缺陷，由于藥物被置于骨水泥水化環(huán)境中，它有可能影響水泥的固化過程，從而影響骨水泥的凝結(jié)時間和強度；分散在水泥固化體中的藥物也不容易釋放出來。微球作為一種緩釋給藥體系，具有能保護藥物免遭破壞、控制藥物釋放速度、延長藥物作用時間、減少藥物不良反應(yīng)及降低用藥量等優(yōu)點[14-15]。脂質(zhì)體是一種無毒、無免疫原性的藥物載體，用于藥物釋放，能提高藥效，降低毒副作用[16-17]。本研究將用脂質(zhì)體包裹抗生素藥物(鹽酸萬古霉素)，形成載藥脂質(zhì)體微球，將載藥脂質(zhì)體與缺鈣磷灰石水泥多孔支架復(fù)合，形成脂質(zhì)體載藥磷灰石水泥支架，用于骨缺損的修復(fù)及治療由于感染而引起的慢性骨髓炎。

1 實驗部分

1.1 缺鈣磷灰石水泥支架的制備

磷酸四鈣(TECP)和磷酸氫鈣(DCPA)的制備參見相關(guān)文獻，將TECP和DCPA粉碎、分級，獲得需要粒度的粉末[1-2,18]。將TECP和DCPA按一定的物質(zhì)的量比混合均勻(鈣磷比為1.58)，即為本實驗制備的缺鈣CPC粉末。將缺鈣CPC粉末、食鹽(450 μm左右)和固化液(水)按一定比例放入瑪瑙研缽中調(diào)和，調(diào)和后的漿體放入不銹鋼模具，模具在置于37℃、100%的濕度環(huán)境中，使水泥固化；固化48 h后取出，放入水中，每6 h換水1次，換3次，取出支架，放在100℃烘箱中加熱12 h，最后得到缺鈣磷灰石水泥支架。用同樣的方法制備鈣磷比為1.67的磷灰石水泥支架作為對照樣品。用XRD表征其物相。

1.2 載藥脂質(zhì)體的制備及其與缺鈣磷灰石支架的

復(fù)合

稱取鹽酸萬古霉素、氫化大豆卵磷脂和膽固醇溶于10 mL無水乙醇中，使鹽酸萬古霉素的濃度為1 mg·mL-1，氫化大豆卵磷脂和膽固醇的總濃度為10 mg·mL-1，于 40 ℃水浴、轉(zhuǎn)速 150 r·min-1減壓蒸除有機溶劑，室溫減壓干燥12 h。加入含有吐溫-80的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，充分溶脹，于冰浴中超聲15 min，將薄膜完全洗脫，再超聲2 min，得白色的載藥脂質(zhì)體混懸液。稱取1 g缺鈣磷灰石支架多個樣品，將載藥脂質(zhì)體混懸液滴加支架上，室溫干燥，得到脂質(zhì)體包裹鹽酸萬古霉素復(fù)合缺鈣磷灰石支架(ld-CPC)，用SEM觀測ld-CPC支架的微觀結(jié)構(gòu)和形貌。稱取1 g缺鈣磷灰石支架多個樣品，滴加200 μL的鹽酸萬古霉素溶液 (1 mg·mL-1)，室溫干燥，得直接載藥缺鈣磷灰石支架(d-CPC)。通過換算使每克缺鈣磷灰石支架載同樣量的鹽酸萬古霉素。用島津萬能材料試驗機(AG-2000A型)測試脂質(zhì)體載藥復(fù)合缺鈣磷灰石支架的抗壓強度，樣品大小(Ф 5×5 mm)，施加荷載速度為 2 mm·min-1，每組數(shù)據(jù)至少有5個平行實驗。缺鈣CPC和脂質(zhì)體載藥缺鈣磷灰石水泥的孔隙率用阿基米德方法測試，每組數(shù)據(jù)至少有3個平行實驗，結(jié)果取平均值。

1.3 細胞在載藥缺鈣CPC支架上增殖

采用MTT法測定MC3T3-E1細胞在載藥缺鈣磷灰石水泥支架上的光密度值(OD)，表征細胞的增殖情況。將載藥支架材料(Ф 5×3 mm)放入24孔的組織培養(yǎng)板中，將MC3T3-E1細胞以3×104數(shù)量接種在每孔支架材料上，每孔加入2 mL的細胞培養(yǎng)基；孵育1和3 d。在測試時間點，每孔加入100 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，然后每孔加入1 mL二甲基亞砜(DMSO)，在37℃下靜置10 min；用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定每孔的OD值，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)表示成平均值＋標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。用方差分析，p＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 載藥缺鈣磷灰石水泥支架的抗菌性能

將載藥缺鈣磷灰石水泥多孔支架材料磨成粉末，取2組粉體。每組稱取0.2 g粉體，放入試管中。每試管加入200 μL(107mL-1)濃度的細菌液(大腸桿菌)，再加入5 mL生理鹽水。將4只試管一起放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后，將每只試管里的菌液分別稀釋10倍、100倍和1 000倍，各取200 μL涂板，每個濃度涂3塊板。將涂好的培養(yǎng)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h，計數(shù)培養(yǎng)板上菌株的數(shù)量，計算材料的抗菌率，并拍照。

1.5 載藥缺鈣磷灰石水泥支架的體外藥物釋放

將直接載藥缺鈣CPC支架(d-CPC)和脂質(zhì)體載藥復(fù)合缺鈣CPC(dl-CPC)支架置于50 mL的小燒杯中，加入20 mL的PBS溶液。從開始加入水時開始計時，分別在 1 h，6 h，12 h，24 h，2 d，4 d，7 d，10 d，14 d后，取一定體積的溶液(支架釋放鹽酸萬古霉素后)，再補充同樣體積的PBS溶液。在280 nm波長下，測定溶液的吸光度值，換算出從缺鈣CPC支架材料中釋放的鹽酸萬古霉素量。載藥缺鈣磷灰石支架釋放藥物后，用SEM觀測支架的微觀結(jié)構(gòu)和形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 缺鈣磷灰石水泥支架材料的XRD

圖1是缺鈣磷灰石水泥支架的粉末X射線衍射圖，采用nCa/nP=1.67的CPC為對照樣，由圖可見，缺鈣磷灰石水泥支架材料和對照樣在 25°，29°，32°，34°，39°，43°，49°等位置的附近都出現(xiàn)了明顯的磷灰石特征峰，這些峰的具體位置在兩個XRD圖中略有不同，這可能是由于它們的Ca/P比不同造成的(材料的晶面間距略有不同)。結(jié)果提示：缺鈣磷灰石水泥支架材料和CPC(nCa/nP=1.67)都具有磷灰石結(jié)構(gòu)，缺鈣磷灰石水泥支架材料是一種類羥基磷灰石，類羥基磷灰石與羥基磷灰石相比，由于鈣缺失，造成其磷灰石結(jié)構(gòu)有缺陷，不穩(wěn)定，其在水中的溶解性比羥基磷灰石高，因而材料在體內(nèi)具有更好的降解性[19]。

2.2 載藥缺鈣磷灰石水泥支架的微觀形貌及抗壓強度

圖2a是載藥脂質(zhì)體復(fù)合缺鈣磷灰石水泥(dl-CPC)支架的照片。圖2bc是dl-CPC支架的SEM照片，顯示的是載藥支架的微觀結(jié)構(gòu)和形貌。載藥脂質(zhì)體支架含有不規(guī)則的大孔，均勻地分布在多孔支架中，大孔之間相互連通，大孔徑在300～500 μm的范圍內(nèi)。大孔的孔壁大約100 μm厚，有些大孔之間有約50～100 μm的連通孔，使得大孔之間相互貫通。高倍電鏡下顯示：有許多載藥脂質(zhì)體粘附在缺鈣CPC支架的大孔壁上，這是由于支架材料表面吸附載藥脂質(zhì)體而形成的。由于缺鈣CPC的水化反應(yīng)以及少量食鹽溶于固化液，多孔支架含有大量微孔，這些微孔可以吸附載藥脂質(zhì)體，將載藥脂質(zhì)體吸附在微孔里或其表面，缺鈣磷灰石水泥支架不僅具有很好的降解性，而且還具有很好的成骨性，有利于骨缺損的快速修復(fù)[20-21]。

表1顯示的是dl-CPC對其抗壓強度的影響，未載藥缺鈣CPC支架為對照。由圖可見，支架的孔隙率明顯影響支架材料的抗壓強度，隨著dl-CPC支架孔隙率的增加(51%～78%)，支架的抗壓強度不斷降低 (3.2～1.9 MPa)。比較載藥脂質(zhì)體復(fù)合缺鈣CPC(dl-CPC)支架和未載藥缺鈣CPC支架，dl-CPC支架對其強度略有提高，但提高的數(shù)值不多。這可能是載藥脂質(zhì)體填充了一些多孔支架的孔隙，對支架材料起了一定的增強作用，這對增加支架植入初期的強度是有用的，隨著藥物的釋放及脂質(zhì)體的快速降解，不影響細胞/組織長入支架材料。

表1 缺鈣CPC支架復(fù)合載藥脂質(zhì)體的抗壓強度Table 1 Compressive strength of scaffold of liposome loaded drug and calcium deficient apatite cement(dl-CPC)

2.3 載藥缺鈣CPC多孔支架的細胞增殖

圖3顯示的是通過MTT法測試MC3T3-E1細胞在載藥脂質(zhì)體復(fù)合缺鈣CPC(dl-CPC)支架上的光密度值(OD值)，表示細胞在支架上的增殖情況。對照組：缺鈣CPC支架(CPC)，直接載藥缺鈣CPC支架(d-CPC)和組織培養(yǎng)板(TCP)。從圖可以看出：所有樣品隨著細胞培養(yǎng)時間的延長 (1和3 d)，OD值都增加，說明所有樣品都有很好的細胞相容性，有利于細胞增殖。在第1和第3 d，實驗組和對照組的吸光度值沒有顯著性的差異。結(jié)果表明：說明dl-CPC支架沒有細胞毒性，細胞相容性良好。

2.4 載藥缺鈣CPC支架的抗菌性能

圖4是載藥脂質(zhì)體復(fù)合缺鈣CPC(dl-CPC)支架抑制大腸桿菌生長的效果圖(實驗時間12 h，圖片放大倍數(shù)都為10倍)，圖中的白色顆粒為大腸桿菌。12 h后，dl-CPC支架組的細菌幾乎不存在，說明dl-CPC支架具有優(yōu)良的抗菌性能。d-CPC支架組有少量細菌，這可能是由于藥物沒有本脂質(zhì)體包裹，藥物從支架上釋放太快，所以，總的殺菌效果欠佳。而未載藥缺鈣CPC支架組有大量細菌，說明缺鈣CPC沒有抗菌性能，不能抑制細菌生長。結(jié)果表明：dl-CPC支架有良好的抗菌作用，能有效地抑制大腸桿菌的生長。

圖5顯示是載藥脂質(zhì)體復(fù)合缺鈣CPC(dl-CPC)支架的抗菌率(1和12 h)，結(jié)果表明：實驗1 h后，dl-CPC支架的抗菌率為81%；實驗12 h后，其抗菌為99%；而直接載藥缺鈣CPC支架在1和12 h的抗菌率分別是69%和87%；而未載藥缺鈣CPC支架在實驗1和12 h后的抗菌率為0，表明無抗菌作用。結(jié)果表明：dl-CPC支架具有很好的抗菌效果，這可能是由于脂質(zhì)體載藥可以實現(xiàn)藥物在支架上緩慢釋放，持續(xù)地殺死細菌，其抗菌率最高。

2.5 載藥CPC支架釋放藥物及釋藥后的微觀形貌

圖6是載藥脂質(zhì)體復(fù)合缺鈣CPC(dl-CPC)支架在PBS中的藥物釋放。對于d-CPC支架，在第1周，藥物有較快的釋放速度，很快達到平臺，表明大部分藥物已經(jīng)從支架里釋放出來了。d-CPC支架在PBS中存在藥物暴釋現(xiàn)象，鹽酸萬古霉素從CPC支架中很快就釋放出來了，缺鈣CPC支架有較大的孔隙率，不僅能吸附藥物，而且能快速地釋放藥物。相對于d-CPC支架的藥物釋放，脂質(zhì)體包裹鹽酸萬古霉素復(fù)合多孔支架的藥物釋放有明顯的差別。在開始階段，藥物釋放沒有出現(xiàn)暴釋現(xiàn)象，藥物從支架里緩慢釋放出來。4周后，達到平臺，表明大部分藥物已經(jīng)從支架里釋放出來了，釋放周期明顯比直接載藥缺鈣CPC支架長。脂質(zhì)體是一種人工膜，具有雙層脂分子的球形囊泡，將藥物包裹在囊泡中，可以緩釋藥物，從而使藥物從支架里緩慢釋放出來。相比于支架直接載藥，脂質(zhì)體包裹藥物復(fù)合CPC支架具有更好的緩釋效果，可提高藥物的利用度[22]。

圖7是載藥脂質(zhì)體復(fù)合缺鈣CPC支架(dl-CPC)釋藥后的微觀結(jié)構(gòu)和形貌(SEM照片)：從圖可以看出，由于脂質(zhì)體的降解，藥物從缺鈣CPC支架里緩慢釋放出來，支架表面出現(xiàn)了許多微孔，再加上支架材料本身的降解，支架材料表面產(chǎn)生了一些微孔。這些微孔結(jié)構(gòu)有利于細胞/組織粘附在支架材料上，進一步生長和繁殖，形成骨組織。隨著支架材料的降解，骨組織最終代替支架材料而修復(fù)骨缺損。在載藥支架植入體內(nèi)的前期，緩慢地釋放抗生素有利于創(chuàng)傷處的消炎，抑制傷口處細菌生長，因此，dl-CPC支架可用于骨缺損的修復(fù)及治療伴隨的慢性骨髓炎。

3 結(jié) 論

采用食鹽粒子溶出法制備了缺鈣磷灰石水泥支架，將脂質(zhì)體包裹鹽酸萬古霉素，形成載藥脂質(zhì)體，將載藥脂質(zhì)體與支架復(fù)合，制備了載藥缺鈣磷酸鈣水泥支架(dl-CPC)。結(jié)果表明：缺鈣CPC支架能夠吸附載藥脂質(zhì)體；與支架直接吸附藥物相比，dl-CPC支架具有很好的抑菌效果，抗菌率達到99%(12 h)。dl-CPC支架具有很好的細胞相容性，對細胞生長沒有負(fù)面影響。

與直接吸附藥物的缺鈣CPC支架相比，dl-CPC支架在PBS溶液中的釋放藥物比較緩慢，沒有出現(xiàn)暴釋現(xiàn)象；而直接吸附藥物的缺鈣CPC支架第1周內(nèi)出現(xiàn)了快速釋放(瀑釋)。結(jié)果表明：脂質(zhì)體包裹藥物有利于藥物從缺鈣CPC支架上緩慢釋放出來。dl-CPC支架具有緩釋藥物和骨修復(fù)雙重功能，可用于骨缺損的修復(fù)及治療伴隨的慢性骨髓炎。

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Composite Scaffold of Liposome Loaded Drug and Calcium Deficient Apatite Cement

LIANG Wei1XU Jian1GE Shu-Hua1DU Jun-Jie1YANG Min1YAN Ming1LUO Zuo-Jing＊,1SU Jia-Can2LIU Chang-Sheng3
(1Department of Orthopaedics,Xijing Hospital,Four Militarry Medical University,Xi′an 710199,China)
(2Department of Orthopaedics,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
(3Engineering Research Center for Biomedical Materials of Ministry of Education,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Calcium deficient apatite cement(CPC)scaffold was prepared by using salt particle leach method,liposome loaded drug (Vancomycin hydrochloride)was also fabricated.Composite scaffold of liposome loaded drug and calcium deficient apatite cement(dl-CPC)was developed by combination of both them.The results showed that the calcium deficient CPC could adsorb liposome loaded drug on both the wall of the macropores and micropores of the scaffold.The dl-CPC scaffold loaded drug had no negative effects on MC3T3-E1 cells growth,showing good cytocompatiblity.In addition,the dl-CPC scaffold had good antibacterial properties,which could inhibit the growth of E.coli,and the antibacterial ratio could reach 99%after incubated for 12 hours.The drug was slowly released from the dl-CPC scaffold l(in the first 4 weeks),when the dl-CPC soaked into in phosphate buffer solution(PBS).However,waterfall release of drug was found that the great mass of drug was released from the CPC scaffold directly loaded drug in the first week.The results suggested that the dl-CPC scaffold had two functions of bone regeneration and drug slow release,which can be used for bone defects repair and therapy of chronic osteomyelitis.

apatite cement scaffold;drug carrier;liposome;antibacterial properties;drug release

R318

A

1001-4861(2012)07-1397-06

2011-11-17。收修改稿日期：2012-01-11。

上海市衛(wèi)生系統(tǒng)新優(yōu)青計劃(No.2010032)；上海市博士后基金；中國博士后科研基金面上項目及國家自然科學(xué)基金(No.81000813)資助項目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：trauma8888@yahoo.com.cn