百合總皂苷提取工藝及抗抑郁活性研究

傅春燕，劉永輝，李明娟，王曉慧，尹文清

1邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校;2湖南省新邵縣紅十字會(huì)醫(yī)院，邵陽 422000;3廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004

百合總皂苷提取工藝及抗抑郁活性研究

傅春燕1*，劉永輝2，李明娟1，王曉慧1，尹文清3

1邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校;2湖南省新邵縣紅十字會(huì)醫(yī)院，邵陽 422000;3廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004

本文研究百合總皂苷最佳提取工藝，繼而采用AB-8大孔吸附樹脂富集純化百合總皂苷，并測試其抗抑郁活性。采用正交實(shí)驗(yàn)，考察乙醇濃度、提取次數(shù)、固液比及提取時(shí)間四個(gè)因素對(duì)該工藝的影響;采用小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)百合總皂苷的抗抑郁活性。確立了百合總皂苷的最佳提取工藝為:提取時(shí)間3 h，乙醇濃度80%，固液比1∶10，提取次數(shù)為3次。在最佳提取工藝條件下，總皂苷提取率為1.24%。經(jīng)過AB-8大孔樹脂富集純化總皂苷的含量達(dá)到62%以上。藥理實(shí)驗(yàn)表明，百合總皂苷中劑量、小劑量能明顯縮短小鼠懸尾的不動(dòng)時(shí)間和游泳時(shí)間(P＜0.05或者P＜0.01)，百合富集純化的總皂苷部位具有較好的抗抑郁活性。

百合總皂苷;提取工藝;抗抑郁活性

百合(Lilium browniiF.E.Brown var.viriulum Baker)為百合科多年生草本植物，為湖南邵陽特色的一種藥食兩用的名貴中藥材，主產(chǎn)于湖南新邵、隆回、邵東等地。百合在歷代本草中均有安神功效的記載，在張仲景《金匱要略》中主要用于治療“百合病”，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抑郁癥屬于“百合病”的范疇。百合鱗莖主要含有甾體皂苷、酚性甘油苷、多糖、氨基酸、磷脂以及微量元素等成分［1-3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，百合具有養(yǎng)陰潤肺，清心安神、止咳、消炎、增強(qiáng)肌體免疫功能等功效［4-6］。中國藥典收載的百合為:卷丹(Lilium lancifoliumThunb.)、百合(Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker.)和細(xì)葉百合(Lilium pumilumDC.)。經(jīng)檢索文獻(xiàn)［7，8］，卷丹總皂苷的提取工藝及其藥理活性有一些報(bào)道。而百合中總皂苷的提取工藝和抗抑郁活性研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文擬采用正交實(shí)驗(yàn)研究了百合總皂苷的最佳提取工藝條件，以總皂苷提取率為指標(biāo)，系統(tǒng)地考察了溶劑濃度、固液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素的影響，最后優(yōu)選出了最佳提取方案，并對(duì)采用該方案提取的百合總皂苷進(jìn)行富集純化及抗抑郁活性評(píng)價(jià)。上述研究為開發(fā)以百合為原料的抗抑郁中藥奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合由湖南康爾佳中藥飲片廠提供，藥材由廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院唐紹清教授鑒定為百合科百合屬植物百合(Lilium browniiF.E.Brown var.viriulum Baker)地下鱗莖部分。薯蕷皂苷對(duì)照品(供含量測定用，批號(hào)111701-200711)購自中國藥品生物制品檢定所。鹽酸氟西汀片:常州四藥制藥有限公司，規(guī)格1 mg/片，批號(hào):070429。其它試劑均為分析純。AB-8大孔吸附樹脂(南開大學(xué))。

5%香草醛溶液:稱取香草醛0.5 g，置于10 mL容量瓶中，冰醋酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。KM小鼠，♀♂各半，體重18～20 g，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取工藝

稱取百合干燥鱗莖10.0 g，按表1所示的正交條件，采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇加熱回流提取，合并所得浸膏加水溶解，依次用乙醚、水飽和的正丁醇萃取，合并并減壓蒸干萃取液，干燥得到百合總皂苷。

1.3.2 百合總皂苷類成分的定量測定方法

以薯蕷皂苷為對(duì)照品，根據(jù)甾體皂苷類化合物的香草醛-高氯酸顯色反應(yīng)，用分光光度法測定皂苷含量并計(jì)算百合總皂苷提取率。

精密吸取樣品溶液1 mL置于10 mL瓶中，低溫烘干溶劑，冷卻，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，再加入高氯酸0.7 mL，混勻，置于60℃水浴20 min，取出，迅速冷卻。精密加入冰醋酸液5 mL，搖勻，在暗處放置30 min，在535 nm波長處測定吸光度，計(jì)算樣品中總皂苷的總量。

皂苷提取率% ={(提取液中皂苷總量)/(所用百合原料量)}×100%

1.3.3 正交實(shí)驗(yàn)

選取乙醇濃度、提取溫度、固液比及提取時(shí)間四因素作L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

1.3.4 百合總皂苷的純化

1.3.4.1 樹脂預(yù)處理

將AB-8樹脂用95%乙醇浸泡12 h后，濕法裝柱，用95%乙醇4BV(4倍柱體積)動(dòng)態(tài)清洗，再用水洗至無醇味;然后依次用5%鹽酸(浸泡3 h后，3BV清洗，水洗至中性)和5%NaOH(浸泡3 h后，3BV清洗，然后水洗至中性)處理;最后用95%乙醇清洗至乙醇洗脫液與水混合(1∶5)不呈白色混濁為止;用水洗至無醇味，備用。

1.3.4.2 樹脂的吸附和解吸

將已預(yù)處理AB-8大孔樹脂裝入柱中，將按最佳工藝提取的皂苷粗提液上柱至接近飽和。用蒸餾水洗至流出液為無色，后改用80%乙醇解吸，得解吸液。

1.3.4.3 產(chǎn)品的處理

解吸液真空干燥至恒重。按“1.3.2”項(xiàng)下方法操作，測定紫外吸光度，計(jì)算解吸液中總皂苷化合物的含量。按下式計(jì)算皂苷的純度:總皂苷的純度= (W/Wo)×100%式中，W為解吸液中皂苷的含量(mg);Wo為解吸液干燥后的重量(mg)。純化后皂苷的純度見表5。

1.3.5 抗抑郁活性的測定方法

1.3.5.1 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)［9］

給藥7 d后將小鼠懸于懸尾裝置(鐵架臺(tái))，具體操作:用醫(yī)用膠布粘在小鼠尾部距尾尖1 cm處，距桌面15 cm處，讓小鼠預(yù)適應(yīng)1 min，記錄5 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間。

1.3.5.2 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)［10］

小鼠游泳絕望將小鼠放入水深10 cm、直徑20 cm的桶內(nèi)，水溫保持在25℃。小鼠在初放入水桶內(nèi)時(shí)，拼命游泳并試圖爬上桶壁，一段時(shí)間后，小鼠因失望而活動(dòng)減弱，活動(dòng)之間有較長時(shí)間的不動(dòng)間歇，表現(xiàn)為身體微曲，保持垂直姿勢(shì)，鼻孔露出水面，并且間歇時(shí)間越來越長。末次給藥1 h后，將小鼠放入桶內(nèi)，預(yù)適應(yīng)2 min，記錄后5 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。

1.3.6 百合總皂苷的活性測試

根據(jù)參考文獻(xiàn)［11］，百合約30 g，按照人體表面積換算，小鼠約為60 kg體重成人用量的10倍。該劑量設(shè)為中劑量，大劑量為中劑量的2倍，小劑量為中劑量的1/2倍。陽性藥氟西汀4 mg/kg，為60 kg體重成人日用量的20倍。百合皂苷大劑量為0.13 g皂苷/kg。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件處理分析，組間差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合總皂苷的定量測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

薯蕷皂苷對(duì)照品經(jīng)香草醛-高氯酸顯色后于TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)上作最佳吸收波長掃描并繪制掃描曲線，顯色后，反應(yīng)產(chǎn)物在535 nm處有最大吸收且反應(yīng)2 h內(nèi)其吸光度保持穩(wěn)定。

精密吸取薯蕷皂苷對(duì)照品溶液(濃度為0.10 mg/L)0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，置10 mL西林瓶中，低溫烘干溶劑，冷卻，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，再加入高氯酸0.7 mL，混勻，置于60水浴20 min，取出，迅速冷卻。精密加入冰醋酸液5 mL，搖勻，在暗處放置30 min，在535 nm波長處測定吸光度。隨行空白。以薯蕷皂苷對(duì)照品取樣量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=6.4391X+0.0171，r=0.9994(n=8)。結(jié)果表明，薯蕷皂苷在0.04～0.16 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 百合總皂苷的提取率測定

稱取30.0 mg按各工藝制備的浸膏，溶于甲醇并定容至100 mL，測定其百合總皂苷的提取率，結(jié)果見表2。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果

［12］，用乙醇為溶劑提取的四因素、三水平正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1，結(jié)果見表2，對(duì)表中皂苷提取率進(jìn)行方差分析和顯著性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

通過比較各因素的極差值R可以看出，影響總皂苷的因素順序?yàn)镈＞A＞B＞C，得到最佳提取條件為A2B3C3D3，具體見表2。從表3可以看出，乙醇濃度、提取次數(shù)和時(shí)間對(duì)總皂苷的提取有顯著性影響，并考慮百合總皂苷的提取率和實(shí)際生產(chǎn)情況，最終確定的最佳提取條件為:D3A2B3C3，即用10倍于藥材的乙醇(濃度為80%)，加熱回流3 h提取百合總皂苷，提取次數(shù)為3次。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result analysis of orthogonal test［L9(34))］

9 3 3 2 1 0.51 k12.59 2.07 2.31 1.70 k22.62 2.20 2.29 2.43 k31.81 2.75 2.42 2.89 K10.86 0.69 0.77 0.57 K20.87 0.73 0.76 0.81 K30.60 0.92 0.81 0.96 R 0.27 0.23 0.05 0.39

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal design

2.3 最佳提取工藝的驗(yàn)證

精密稱取3份干燥的百合鱗莖20 g，按最佳工藝條件平行操作，按照“1.3.2”項(xiàng)下的方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程得出總皂苷的含量。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果詳見表4。

表4 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of verification test

由表4可知，根據(jù)最佳工藝條件提取，提取物總皂苷含量均高于其它各正交試驗(yàn)值，RSD=2.48% (n=3)，結(jié)果表明，此工藝重現(xiàn)性好。

表5 純化后總皂苷的含量(n=3)Table 5 The content of total saponins after purification by AB-8 macroporous resin(n=3)

2.4 百合總皂苷抗抑郁活性研究

百合總皂苷中劑量、小劑量能明顯縮短小鼠懸尾的不動(dòng)時(shí)間和游泳時(shí)間(P＜0.05或者P＜0.01)，這說明百合總皂苷具有較好的抗抑郁活性。具體結(jié)果見表6和表7。

3 結(jié)論

3.1 過正交實(shí)驗(yàn)，選出最佳工藝:提取時(shí)間為3 h，

表6 百合總皂苷對(duì)小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的影響Table 6 Aralia elata Lily saponins on the impact of mouse tail suspension test

m乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，固液比為1∶10，提取次數(shù)為3次。正交試驗(yàn)的方差分析表明，提取時(shí)間、提取次數(shù)和乙醇的濃度是影響提取效果的顯著因素。因此，提取過程中要注意控制提取時(shí)間和乙醇的濃度。

3.2 使用大孔樹脂操作簡單，成本低廉，對(duì)粗總皂苷純化效果顯著，有較高的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)過AB-8大孔樹脂富集純化總皂苷的含量達(dá)到62%以上。

3.3 抗抑郁活性實(shí)驗(yàn)表明:百合總皂苷中劑量、小劑量能明顯縮短小鼠懸尾的不動(dòng)時(shí)間和游泳時(shí)間，表現(xiàn)出好的抗抑郁活性。

表7 百合總皂苷對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響Table 7 The effects of forced swimming test of mice in Aralia elata Lily saponins

參考文獻(xiàn)

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Extraction and Purification Techniques and Antidepression Activity of Total Saponins from Bulbs of Lilium brownii

FU Chun-yan1*，LIU Yong-hui2，LI Ming-juan1，WANG Xiao-hui1，YIN Wen-qing3

1Department of Pharmacy，Shaoyang Junior Medicine College;2Red Cross Hospital at Xinshao County of Hunan Province，Shaoyang 422000，China;3Key Laboratory for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources，Ministry of Education of China，College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China

Extraction and purification techniques of total saponins from bulbs ofLilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker.and the antidepressant activity of the total saponins were studied in this paper.Based on orthogonal design，four factors in extraction of saponins from bulbs ofLilium browniewere optimized:concentration of ethanol，reflux time，solid/liquid ratio and extraction times.The optimized process for extracting total saponins from bulbs ofLilium browniiwas confirmed as follows:reflux time，3 h;alcohol，80%;solid/liquid，1∶10;extraction 3 times.The highest extraction rate reaches 1.24%.Then，the extract of total saponins was separated and purified by AB-8 porous resin absorption and the total saponins content reaching 62%.In antidpression effect filtration study，the mouse tail suspended experiment，mouse forced swimming experiment were performed，the result showed that the total saponins was the main antidepression component.The above results showed that the total saponins had certain antidepressant activity.

total saponins;Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker.;extracting process;antidepression

R914

A

1001-6880(2012)05-0682-05

2011-05-17 接受日期:2011-11-15

湖南省教育廳科研基金項(xiàng)目(10C0294)

*通訊作者 Tel:86-013762850152;E-mail:Chunyanfull@yahoo.com.cn