兒茶素及茶黃素單體間清除羥自由基能力研究

涂云飛，楊秀芳，孔俊豪，張士康，朱躍進(jìn)，王盈峰

中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，杭州 310016

兒茶素及茶黃素單體間清除羥自由基能力研究

涂云飛*，楊秀芳，孔俊豪，張士康，朱躍進(jìn)，王盈峰

中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，杭州 310016

本文通過二次通用旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)考察兒茶素體系和酯型兒茶素-茶黃素體系中各成分間的抗氧化能力強(qiáng)弱及相互間協(xié)同清除羥自由基能力。結(jié)果表明:兒茶素與茶黃素中的各成分隨含量增加，清除能力亦隨之增加，其中TF-D-G增加至一定濃度后，其效率有降低的趨勢。兒茶素體系中各成分清除羥自由基能力為:ECG＞EC＞EGCG，其中ECG的貢獻(xiàn)率達(dá)到了43%以上，而EGC在該體系中貢獻(xiàn)不明顯;酯型兒茶素-茶黃素體系中的羥自由基清除能力主要表現(xiàn)為:TF-D-G＞TF-M-G＞ECG＞EGCG＞TF，其中TF-D-G占對優(yōu)勢(貢獻(xiàn)率為51.91%)，而兒茶素清除自由基能力卻未能有效發(fā)揮，每組中各成分之間的協(xié)同作用微弱。

兒茶素;茶黃素;羥自由基;化學(xué)發(fā)光;流動(dòng)注射

圖1 表兒茶素與茶黃素結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Epi-catechins and theaflavins

茶鮮葉按不同的加工工藝［1］，可被制成綠茶，烏龍茶及紅茶。其中烏龍茶及紅茶中不僅含有兒茶素，還有一定量的兒茶素經(jīng)酶促氧化聚合形成的茶黃素(結(jié)構(gòu)如圖1所示)，這些成分不僅構(gòu)成了茶葉的特征性品質(zhì)成分，而且對人類健康的保護(hù)方面發(fā)揮了重要作用［2-5］。

通常，綠茶中酯型兒茶素比簡單兒茶素的摩而數(shù)高出約3～5倍［2，6，7］，而經(jīng)酶促反應(yīng)后，表型簡單兒茶素(EC和EGC)則會消耗怠盡，酯型兒茶素(EGCG和ECG)會有一定量的殘存。傳統(tǒng)工藝條件下，兒茶素的消耗與茶黃素的生成不成比例。有研究表明［8］，兒茶素的消耗可能是因?yàn)榉宇惷复偻瑫r(shí)生成的雙氧水被過氧化物酶利用而產(chǎn)生的羥自由基攻擊兒茶素，降低了茶黃素的生物合成。然而至今未有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)。因此本文模擬過氧化物酶分解過氧化氫，利用芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基攻擊多酚類物質(zhì)，目的是通過二次通用旋轉(zhuǎn)回設(shè)計(jì)探索兒茶素和茶黃素單體對羥自由基清除能力及其協(xié)同清除效果，從而有望為紅茶中兒茶素大量消除，而茶黃素未能成比例生成這一機(jī)理提供一些前期性的基礎(chǔ)研究結(jié)果，為提高紅茶中茶黃素含量作一些鋪墊性的工作。

1 材料與方法

1.1 試劑

兒茶素單體(上海友思生物技術(shù)有限公司);茶黃素單體自制［12］;硅膠(60～200目，島海洋化工廠);Sephadex LH-20(安瑪西亞有限公司);魯米諾(≥98%，蘇州工業(yè)園區(qū)亞科化學(xué)試劑有限公司)，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司);分析天平(梅特勒 AL-204);定量加樣器(上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司)。

1.3 羥自由基清除能力測定

羥自由清除能力測定采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［9］。即將雙氧水(8.4%，v/v)通過六通閥注射進(jìn)入約100 μL定量環(huán)，再與含有魯米諾(2.0×10-4mol/L)、Fe2+-EDTA(6.0×10-2mol/L)及含兒茶素或茶黃素的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4，0.05 mol/L)載流相混合后進(jìn)入光電倍增管，記錄化學(xué)發(fā)光信號?？瞻讟右运〈鷥翰杷鼗虿椟S素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其清除能力通過抑制發(fā)光體系(Fe2+-H2O2-魯米諾體系)［10］來衡量。清除率=(1-Si/S0)×100%，Si為實(shí)際發(fā)光面積，S0為空白發(fā)光面積。.

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上分兩組，組ⅰ為四個(gè)表兒茶素單體，組ⅱ為茶黃素單體與酯型表兒茶素間的羥自由基清除能力比較。實(shí)驗(yàn)實(shí)施以二次通用旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)［11］為基礎(chǔ)，每一獨(dú)立變量的變化在5個(gè)無量綱編碼水平(-r，-1，0，+1，+r)，并確定了兒茶素與茶黃素單體因素的體積濃度變化范圍(見表1)。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)水平編碼表Table 1 Coded levels of variables of the central composite experimental design

組ⅰ為31次實(shí)驗(yàn)實(shí)施，包括16次因子設(shè)計(jì)實(shí)施，8次坐標(biāo)軸點(diǎn)實(shí)施，和7次重復(fù)中心設(shè)計(jì)實(shí)施;組ⅱ為32次實(shí)驗(yàn)實(shí)施，包括16次因子設(shè)計(jì)實(shí)施，10次坐標(biāo)軸點(diǎn)實(shí)施，和6次重復(fù)中心設(shè)計(jì)實(shí)施，其實(shí)施結(jié)果見表2。

表2 二次通用回歸旋轉(zhuǎn)模型試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 General quadratic regression central composition design experiment and experimental result employed for evaluating the antioxidant ability

2 1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 80.01 66.88 3 1 1 -1 1 1 1 -1 1 -1 78.16 71.75 4 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 71.76 74.08 5 1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 81.16 70.93 6 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 77.70 73.39 7 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 75.50 73.76 8 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 68.06 60.56 9 -1 1 1 1 -1 1 1 1 -1 77.19 69.77 10 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 72.69 70.49 11 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 1 68.72 74.66 12 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 60.55 60.22 13 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 1 75.93 73.47 14 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 71.51 62.84 15 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 68.84 64.70 16 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 58.02 68.97 17 2 0 0 0 2 0 0 0 0 77.07 74.98 18 -2 0 0 0 -2 0 0 0 0 66.48 67.46 19 0 2 0 0 0 2 0 0 0 74.61 71.15 20 0 -2 0 0 0 -2 0 0 0 72.62 67.13 21 0 0 2 0 0 0 2 0 0 80.29 72.93 22 0 0 -2 0 0 0 -2 0 0 62.65 70.39 23 0 0 0 2 0 0 0 2 0 77.59 70.74 24 0 0 0 -2 0 0 0 -2 0 67.78 66.31 25 0 0 0 0 0 0 0 0 2 73.06 74.31 26 0 0 0 0 0 0 0 0 -2 73.37 61.39 27 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72.85 69.98 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75.21 69.40 29 0 0 0 0 0 0 0 0 0 74.09 70.07 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 73.21 68.91 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 73.19 71.32 3200 0 0 0 78.24 69.48

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及響應(yīng)面分析采用統(tǒng)計(jì)軟件Matlab6.0進(jìn)行。并利用ANOVA評價(jià)各統(tǒng)計(jì)參數(shù)(P＜0.05表示差異顯著)。

2 結(jié)果

2.1 回歸模型的系數(shù)建立與檢驗(yàn)

利用統(tǒng)計(jì)軟件對表2中的實(shí)施過程所取得的羥自由基清除率進(jìn)行系數(shù)回歸與方差分析，結(jié)果如表3和表4所示。兩組體系中方程的回歸均顯著，組ⅰ與組ⅱ的P值均小于0.01，并且兩組數(shù)據(jù)的回歸方程的失擬性的概率P均大于0.05，說明方程能夠擬合真實(shí)值。

表3 次響應(yīng)回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted mathematical model to an experimental data set using multiple regression

考慮到因子間存在交互作用，因此，各因素的一次，交互及二次項(xiàng)的回歸系數(shù)以P值與各因素的貢獻(xiàn)率綜合考慮，忽略各因素的P＜0.05，得到組ⅰ與組ⅱ的回歸方程為:

組ⅰ中，各因子的二次項(xiàng)均不顯著，同時(shí)交互項(xiàng)亦只有C1×3和C3×4項(xiàng)達(dá)到顯著水平，一次項(xiàng)中，除C2不顯著外，其余三因素均達(dá)到顯著水平，并且三因子的單因素水平的貢獻(xiàn)率超過80%。對于組ⅱ來說，各單因子均達(dá)到顯著性水平，二次項(xiàng)中，F(xiàn)1、F3、F5達(dá)到顯著水平，與組ⅰ相似，各因子的交互作用很微弱，并且ECG與TFDG分別為兩組中對于羥自由基的清除率具有絕對的優(yōu)勢。

表4 二次通用旋轉(zhuǎn)回歸模型因子系數(shù)及清除能力貢獻(xiàn)率Table 4 Regression coefficients of the fitted quadratic equation and factor contribution ratio for the yield of antioxidant ability

C1×4-0.77 3.26 0.089 0.70 F14-0.28 1.52 0.24 0.02 C2×3-0.43 1.02 0.33 0.01 F15-0.30 1.80 0.21 0.07 C2×4-0.55 1.67 0.21 0.21 F23-0.75 11.39 0.0062 1.52 C3×4-1.39 10.51 0.0051 2.96 F240.097 0.19 0.67 -0.18 F25-0.36 2.64 0.13 0.19 F34-0.39 3.17 0.10 0.28 F35-0.82 13.51 0.0037 1.84 F45-1.09 24.12 0.00046 3.45

2.2 數(shù)學(xué)模型分析

2.2.1 主效應(yīng)分析

各因素處理均經(jīng)無量綱線性編碼代換，偏回歸系數(shù)已經(jīng)不受因素取值的大小及單位的影響，其絕對值的大小直接反映了變量對響應(yīng)值的影響程度。但是由于實(shí)驗(yàn)因子存在交互作用，因此各因子對羥自由基的清除率的貢獻(xiàn)大小需進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成貢獻(xiàn)率來衡量。由表4可知，各組中因素間的清除能力按從強(qiáng)至弱的順序依次為:C3(43.96%)＞C1(26.76%)＞C4(17.25%);F5(51.91%)＞F4(15.54%)＞F1(9.71%)＞F2(3.42%)＞F3(2.44%)。比較兩組結(jié)果，雖然兒茶素組中的ECG在該體系中抗氧化能力較強(qiáng)，但是當(dāng)與茶黃素混合后的新體系中，酯型兒茶素ECG發(fā)揮清除羥自由基的能力明顯降低，取而代之的是酯型茶黃素。

2.2.2 單因素效應(yīng)分析

將回歸模型中三個(gè)固定在零水平，得到的單因素模型分別為:

將4個(gè)因素固定在γ、1、0、-1、-γ水平，得到各因子的單因素效果圖2。從圖中可以明顯看出，組ⅰ(圖2-A)中各因素的效應(yīng)隨著自變量的變化直線走向，并且C3的斜率最大，其余次之。而組ⅱ(圖2-B)中，茶黃素雙沒食子酸酯呈現(xiàn)出拋物線狀，從左至右呈現(xiàn)出先快速增長后趨緩的態(tài)勢。而F3呈現(xiàn)出開口向上的拋物線狀說明有最小值點(diǎn)。其余成分變化趨于線性，即在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，每組中的成分對羥自由基的影響主要表現(xiàn)為含量越高，清除能力越大。

圖2 各單因素水平與清除率的回歸曲線Fig.2 Regression curve of scavenge and the levels of each component

2.2.3 單因素邊際效應(yīng)分析

單因素邊際效應(yīng)在二級響應(yīng)面交互作用條件下，主要反應(yīng)清除率隨各因子水平的變化而變化的速率。為了確定各因素的邊際效應(yīng)，將上述所得方程進(jìn)行單因素求導(dǎo)，各方程如下:

從上圖中可以看出，茶黃素及茶黃素單沒食子酸酯隨著編碼值的增加，清除速率快速上升，同時(shí)茶黃素雙沒食子酸酯(F5)的清除速率主要表現(xiàn)為隨編碼值的增加而急劇下降，這亦間接說明，雖然茶黃素雙沒食子酸酯(F5)的濃度增加可以增強(qiáng)羥自由基的清除率，但低濃度時(shí)清除自由基的效率更高，而對于茶黃素(F3)及單沒食子酸酯(F4)則表現(xiàn)出隨濃度的增加，清除羥自由基的效果呈現(xiàn)出上升的趨勢。

圖3 各單因素邊際效應(yīng)Fig.3 Marginal utility of scavenge of each component

2.2.4 兩因素互作效應(yīng)分析

在組1中，分別將兩個(gè)因素固定在零水平，得到另外兩個(gè)因素的模型。分別為，根據(jù)模型做出的響應(yīng)面和等高線圖。

圖4-C說明兒茶素(組ⅰ)中除了C1×3與C3×4因子間的微作用外，主要表現(xiàn)為相互間的交互作用很弱，這主要體現(xiàn)在各水平的等高線呈現(xiàn)出平等的直線。而對于圖4-D來說，響應(yīng)面則被雙因素間的交互作用而扭曲，但是相對于單因素來說，交互作用依然較弱，其總貢獻(xiàn)率不足7%。

3 討論

兒茶素單體在清除自由基或抑制脂質(zhì)過氧化能力方面，不同的研究體系結(jié)果表明酯型兒茶素強(qiáng)于簡單兒茶素，并且酯型或簡單兒茶素中存在著表沒食子型與表兒茶素型強(qiáng)弱順序不定的差異［12-14］，然而這些結(jié)果都是基于兒茶素單體獨(dú)立的抗氧化效果。筆者通過將四種兒茶素同時(shí)暴露于活性氧羥自由基時(shí)，則主要表現(xiàn)為表兒茶素型(ECG和EC)強(qiáng)于表沒食子型兒茶素(EGCG和EGC)，這可能是由于兒茶素在清除羥自由基時(shí)，有著兩種類型相互間自修復(fù)作用［15，16］，達(dá)到重復(fù)利用的可能，從而增強(qiáng)表型兒茶素的抗氧化能力。另一方面，表型與表沒食子型兒茶素的B環(huán)4位酚羥基發(fā)生抽氫后，表型兒茶素B環(huán)上的2位芐氫比表沒食子型兒茶素B環(huán)上的3或5位酚羥基更易于發(fā)生抽氫反應(yīng)［17］，從而導(dǎo)致表型兒茶素在清除自由時(shí)處于優(yōu)勢地位。

對于酯型兒茶素-茶黃素體系，茶黃素單或雙沒食子酸酯＞酯型兒茶素＞茶黃素。在該體系中，茶黃素雙沒食子酸酯對于羥自由清除的貢獻(xiàn)率高于50%，這與兒茶素及茶黃素結(jié)構(gòu)中的沒食子基具有穩(wěn)定兒茶醌或茶黃醌的作用相符合［18］。同時(shí)，這也可以間接說明高茶黃素與兒茶素提取物可更好的改善心腦血管疾病的性狀［4］，因?yàn)椴椟S素與兒茶素的聯(lián)用增強(qiáng)了酯型茶黃素的清除羥自由基能力而發(fā)揮作用。

另有研究表明［6，19］在茶鮮葉酶促發(fā)酵中表兒茶素在氧化的同時(shí)，會降低生成的茶黃素及茶黃素單沒食子酸酯，而對茶黃素雙沒食子酸酯的影響較小，同時(shí)簡單兒茶素則消耗較小，說明茶黃素與兒茶素在同一體系中共同清除自由基時(shí)，相對弱的兒茶素或茶黃素充當(dāng)修復(fù)劑的作用，而保護(hù)了先被自由基攻擊的抗氧化物質(zhì)。

4 結(jié)論

兒茶素與茶黃素的抗氧化能力主要表現(xiàn)為單因子獨(dú)立效應(yīng)，并且各組中ECG或TF-DG在該體系清除自由基中發(fā)揮了將近一半的作用，而其余成分則是發(fā)揮著補(bǔ)充修復(fù)的作用。兩組中各因素的交互作用相對來說弱很多。另外，雖然大量關(guān)于兒茶素及茶黃素的抗氧化能力的強(qiáng)弱研究，但是對于茶鮮葉中的茶黃素含量偏低于理論含量，至今仍然不清。更好的基礎(chǔ)性的理解涉及到關(guān)于兒茶素在氧化過程中的自由基的生成，所以需要研究清楚。至此，更進(jìn)一步的研究關(guān)于兒茶素的酶促氧化及茶黃素合成仍需要進(jìn)行詳細(xì)的研究，這不僅關(guān)系到茶葉的品質(zhì)，更重要的是讓茶葉發(fā)揮應(yīng)有的保健功效，其意義深遠(yuǎn)。

1 College of anhui agronomy(安徽農(nóng)學(xué)院主編).Manufacture of Tea(制茶學(xué))，2edEd.Beijing:China Agriculture Press，1979.1-25.

2 Wan XC(宛曉春).Tea Biochemistry(茶葉生物化學(xué))，1stEd.Beijing:China Agriculture Press，1987.319-358.

3 Joshua DL，Yang CS.Mechanisms of cancer prevention by tea constituents.J Nutr，2003，133:3262s-3267s.

4 David JM，Lu GP，Nai SC，et al.Cholesterol-lowering effect of a theaflavin-enriched green tea extract.Arch Intern Med，2003，163:1448-1453.

5 Sabu MC，Priya TT，Ramadasan K，et al.Beneficial effects of green tea:a literature review.Chin Med(中國醫(yī)藥)，2010，5:13.

6 Shen DY(沈丹玉).Studies on Reaction Characteristics and Optimization of liquid-state fermentation for the production of black tea beverage by flesh leaves.Beijing:Chinese Academy of Agircultural Sciences(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)，MSc.2009.

7 Lin XR(林小端).Analysis of the variation of catechins content in oolong tea germplasm resources.Fuzhou:Fujian Agriculture and Forest University(福建農(nóng)林大學(xué))，Msc.2009.

8 Subramanian N，Venkatesh P，Ganguli SY，et al.Role of polyphenol oxidase and peroxidase in the generation of black tea theaflavins.J Agric Food Chem，1999，47:2571-2578.

9 Tu YF(涂云飛)，Mao ZF(毛志芳)，Yang XF(楊秀芳).Mobile injection and chemical illumination for determining the antioxidation capacity of tea.Chin Tea Proc(中國茶葉加工)，2009，1:42-45.

10 Cheng ZY，Yan GT，Li YZ，et al.Determination of antioxidant activity of phenolic antioxidants in a Fenton-type reaction system by chemiluminescence assay.Anal Bioanal Chem，2003，375:376-380.

11 Yuan ZF(袁志發(fā))，Zhou JQ(周靜芉).Design of Experiment and Analysis(試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析)，2ed.Beijing:Higher Education Press，2000.381.

12 Lai KL，Su YL，Chen RY，et al.Theaflavins in black tea and catechins in green tea are equally effective antioxidants.J Nutr，2001，131:2248-2251.

13 Salah N，Miller NJ，Paganga G，et al.Polyphenolic flavanols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants.Arch biochem Biophys，1995，22:339-346.

14 Chen CW，Ho CT.Antioxidant properties of polyphenols extracted from green and black teas.J Food Lipids，1995，2:35-46.

15 Shen SR(沈生榮)，Yang XQ(楊賢強(qiáng))，Yang FJ(楊法軍)，et al.Coordinatingly synergic effect of catechins during their antioxidation.Tea Sci(茶葉科學(xué))，2003，2:141-146.

16 Chen LJ(陳留記)，Yang XQ(楊賢強(qiáng))，Shen SR(沈生榮)，et al.Mechanismof Scavenging Reactive Oxygen Radicals of Tea catechins.J Zhejiang Univer，Agri＆Life Sci(浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2002，28:573-574.

17 Zhang HY(張紅雨)，Wang LF(王蘭芬).Quantum chemical study of molecular mechanism for green tea poly phenols to scavenge peroxyl radicals.J Zibo Univ(Nat Sci Ed)(淄博學(xué)院學(xué)報(bào)，自科與工程版)，2002，3:5-10.

18 Sobodan VJ，Yukihiko H，Steen S，et al.Antioxidant potential of theaflavins.A pulse radiolysis study.J Am Chem Soc，1997，119:5337-5343.

19 Krishan LB，Toyomasa A，Tojiro T，et al.Effects of(-)-epicatechin on oxidation of theaflavins by polyphenol oxidase from tea leaves.Agric Biol Chem，1987，7:1767-1772.

Antioxidant Capability of Epi-catechins and Theaflavins In Vitro by Scavenging Hydroxyl Free Radical

TU Yun-fei*，YANG Xiu-fang，KONG Jun-hao，ZHANG Shi-kang，ZHU Yue-jin，WANG Yin-feng
Hangzhou Tea research institute，All-China Federation of Supply and Marketing Co-operatives，Hangzhou 310016，China

In this paper，the scavenge ability of hydrogen free radical for both catechins(groupⅰ)and gallate catechintheaflavins(groupⅱ)was investigated by the method of quadratic general rotate regression design.The results indicated that the scavenge ability of each group increased along with the increasing content of each component in the system，except for TF-D-G which mainly played important role at the low concentration.In groupⅰ，the scavenge ability of of each component was in order of ECG＞EC＞EGCG，and the contribution ratio of ECG in this system was more than 43%，which in sharp contrast to negligible component of EGC.As for groupⅱ，the order of each component in the scavenge ability was TF-D-G＞TF-M-G＞ECG＞EGCG＞TF，and the contribution ratio of TF-D-G exceeded 50%.Interestingly，the gallate catechins could not effectively play the role of scavenging the hydrogen free radicals when they mixed with theaflavins.And the synergy effect of components in corresponding group was weak.

catechins;theaflavins;hydrogen free radical;chemiluminescence;flow injection analysis

Q599.5

A

1001-6880(2012)05-0653-07

2011-06-07 接受日期:2011-10-31

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y3100683)

*通訊作者 Tel:86-571-86032092;E-mail:tyfaf@sohu.com