紫球藻多糖化學結(jié)構(gòu)解析

孫利芹，王 凌，馬翠華，王長海

1煙臺大學生命科學學院，煙臺 264005;2大連理工大學環(huán)境與生物工程系，大連 116024

紫球藻多糖化學結(jié)構(gòu)解析

孫利芹1，2*，王 凌1，馬翠華1，王長海2

1煙臺大學生命科學學院，煙臺 264005;2大連理工大學環(huán)境與生物工程系，大連 116024

為明確紫球藻多糖的化學結(jié)構(gòu)，本文采用化學分析和光譜分析方法對紫球藻多糖的一級糖鏈結(jié)構(gòu)進行了分析。GC分析表明該多糖由木糖、葡萄糖和半乳糖組成，為一種雜多糖，其摩爾比為:2.96∶1.25∶3.06;紅外光譜分析結(jié)果顯示紫球藻多糖為硫酸化多糖，糖苷鍵類型為β構(gòu)型;化學分析結(jié)果推斷紫球藻多糖糖鏈連接方式以1→3為主，存在少量1→2，1→4，1→6鍵型，且半乳糖在支鏈或主鏈末端有較大量的存在，木糖和葡萄糖在主鏈或靠近主鏈區(qū)域有特定分布;NMR分析顯示紫球藻多糖的硫酸酯基連在C-6上，且多糖的糖苷鍵為β型; GC-MS聯(lián)機分析進一步確定紫球藻多糖為一種主要含有1→3糖苷鍵，并含有1→4，1→6糖苷鍵的雜多糖。綜合上述分析，推斷出紫球藻多糖的糖鏈主鏈的重復單元結(jié)構(gòu)。

紫球藻;多糖;糖鏈結(jié)構(gòu);化學分析;光譜分析

多糖的生物活性與其空間構(gòu)象、分子量大小、分支度和溶解度有密切關(guān)系，化學結(jié)構(gòu)的微小變化可能對它的構(gòu)象和多糖的特性產(chǎn)生較大的影響［1］。近十幾年，研究者已經(jīng)得到了一系列多糖重復單元的結(jié)構(gòu)，這些多糖的重復結(jié)構(gòu)單元結(jié)構(gòu)通過酸水解、甲基化分析、高碘酸氧化、Smith降解、乙酰解、酶解和1D、2D核磁共振譜等方法被解析［2-4］。但是由于多糖的結(jié)構(gòu)變化多樣、糖鏈結(jié)構(gòu)的復雜性，糖鏈結(jié)構(gòu)分析一直是多糖結(jié)構(gòu)測定的難點。

紫球藻(Porphyridium Cruentum)是目前發(fā)現(xiàn)的紅藻門中唯一的單細胞藻類，細胞生長過程中會大量合成并向胞外分泌一種磺酸化多糖，其分子量達2～7×106Da［5］。近幾年，紫球藻多糖的抗病毒、抗氧化、抗輻射和降低血酯等生物活性相繼被報道［6-9］，然而，對紫球藻多糖糖鏈結(jié)構(gòu)的研究目前除了Gloaguen［4］采用NMR分析了紫球藻多糖降解后的一種寡糖片段的糖鏈連接方式外，其余的報道僅限于對糖鏈單糖組成的分析［4-5，10］。

本研究主要通過化學分析和光譜分析方法，對紫球藻多糖的單糖組成、單糖殘基間的連接測序、糖苷鍵構(gòu)型及重復單元結(jié)構(gòu)等糖鏈的一級結(jié)構(gòu)進行分析，旨在為紫球藻多糖高級結(jié)構(gòu)的研究及多糖結(jié)構(gòu)與功能的構(gòu)效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實驗材料

紫球藻多糖(EPS)，由煙臺大學海洋生化工程研究室提取、純化，經(jīng)冷凍干燥后獲得的白色絮狀固體。

D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、葡萄糖醛酸AR，Sigma公司;L-巖藻糖、L-鼠李糖，AR，Treechem公司;肌醇，AR，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2主要儀器

Shimadzu IR-400型紅外光譜儀(日本島津株式會社)、Agilent6820型氣相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、Agilent1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、MS-GC2010氣質(zhì)聯(lián)用機(日本島津株式會社)、Bruker AVANCE 400 Digital NMR核磁共振儀(德國Bruker公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 單糖組成分析［11］

衍生物的制備—糖醇乙酸酯，以肌醇為內(nèi)標物，具體方法參見文獻［11］。將標準單糖制成糖醇乙酸酯衍生物，直接進行氣相色譜分析，記錄標準單糖的保留時間(RT)。

樣品的測定:多糖樣品20 mg，加入8 mL 2 mol/ L的三氟乙酸，封瓶，120℃下置入高壓滅菌鍋水解2.0 h，水解液于60℃減壓蒸發(fā)至干，105℃烘箱中烘至恒重。稱重，得水解后單糖質(zhì)量，按上述衍生物的制備方法加入各藥品及試劑，產(chǎn)物作氣相色譜分析。記錄樣品中單糖的保留時間，并與標準單糖的氣相色譜圖進行比較，確定紫球藻胞外多糖的單糖組成。

氣相色譜分析條件:色譜柱:HP-5MS毛細管柱(30 m ×0.32 mm ×0.5 μm)、氫火焰離子化檢測器;程序升溫:初始溫度200℃保持2 min，以20℃/ min升溫至240℃，保持2 min，再以5℃/min升溫至250℃，保持1 min;進樣口溫度250℃，進樣量1 μL，以氮氣為載氣，流速2 mL/min。

1.2.2 紅外光譜分析

取干燥的紫球藻多糖EPS0 1.0 mg，以KBr壓片，在4000～400 cm-1的范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，記錄紅外光譜圖。

1.2.3 部分酸水解［11］

分別將30 mg紫球藻多糖與0.05、0.5和1 mol/L的三氟乙酸(TFA)3 mL混合，封管，于75℃水解16 h。用截留分子量為8000 Da的透析袋將水解片斷分級，分別得到袋外上清、袋內(nèi)上清袋內(nèi)沉淀三種組分。

各組分適當濃縮、凍干后，按內(nèi)標法定量，GC分析各單糖相對含量，氣相色譜分析條件同1.2.1。

1.2.4 高碘酸氧化和Smith降解［11］

1.2.4.1 準確稱取糖樣50 mg，用少量水溶解，加入50 mL容量瓶中;準確稱取160.4 mg NaIO4，用少量水溶解后，加入容量瓶中，定容，使NaIO4終濃度為15 mmol/L。

1.2.4.2 放置在暗處反應(yīng)(室溫)，間隔時間(0、6、12、24、36、……，78 h)取樣0.l mL，蒸餾水稀釋后用紫外分光光度計，以蒸餾水作空白對照，在223 nm波長處測光密度值，直到光密度值恒定為止。

1.2.4.3 加乙二醇終止反應(yīng)，高碘酸氧化完成。

1.2.4.4 甲酸測定:取4 mL上述氧化液，加1滴溴甲酚(紅)紫作指示劑，用0.05 mol/L的NaOH(用鄰苯二甲酸氫鉀標定)滴定，計算得甲酸生成量。

1.2.4.5 將乙二醇處理后的溶液用蒸餾水透析48 h，于40℃以下減壓濃縮至小體積，加入硼氫化鈉以還原多糖醛，于室溫暗處攪拌24 h，用0.1 mol/L乙酸調(diào)pH至5.5，以分解剩余的硼氫化物，流水透析48 h，蒸餾水透析過夜，冷凍干燥得多糖醇。

將乙二醇處理后的溶液用蒸餾水透析48 h，袋外部分冷凍干燥做GC分析，袋內(nèi)部分流水，蒸餾水各透析24 h，濃縮，加入NaBH4還原過夜。用50%醋酸中和至pH為6～7。濃縮至10 mL左右，取1/3干燥后做GC分析，剩余部分進行Smith降解。

1.2.4.6 加入等體積的0.2 mol/L TFA，使TFA終濃度為0.1 mol/L。35℃水解30 h，趕除TFA至pH為6～7，用蒸餾水透析48 h，袋外部分干燥做GC分析，袋內(nèi)部分流水，蒸餾水各透析24 h，濃縮，做氣相色譜分析，分析條件同1.2.1。

1.2.5 核磁共振(NMR)分析

將處理好的紫球藻多糖樣品用D2O溶解，室溫條件下，在Bruker AVANCE 400 Digital NMR型核磁共振儀上測試樣品的氫譜和碳譜，對照文獻資料分析圖譜信息。

1.2.6 甲基化分析

1.2.6.1 紫球藻胞外多糖乙?；苌锏闹苽?/p>

0.5 g紫球藻胞外多糖加入到250 mL干燥的三口燒瓶中，加入20 mL甲酰胺，室溫下攪拌30 min使紫球藻胞外多糖溶解，加入體積比為1∶1的吡啶-醋酸酐溶液20 mL，室溫下反應(yīng)24 h，然后加入250 mL蒸餾水反應(yīng)除去多余的醋酸酐，混合液減壓濃縮，濃縮液中加入無水乙醇醇沉，沉淀用無水乙醇洗滌三次，冷凍干燥，得到乙?；嗵茄苌铩?/p>

1.2.6.2 試劑的預(yù)處理:包括碘甲烷的純化，二甲基亞砜的純化和氫氧化鈉粉的制備，方法參見文獻［11］。

1.2.6.3 多糖的甲基化［12］

稱取多糖8 mg于反應(yīng)瓶中，真空干燥5～6 h，干燥后的樣品加入用干燥4A分子篩處理過的3 mL DMSO，室溫磁力攪拌直至多糖樣品完全溶解后加入研磨過的干燥的NaOH粉末20 mg，室溫攪拌10 min，然后改用冰浴5 min，待反應(yīng)瓶中的溶液完全冰凍后，逐滴加入0.6 mL碘甲烷，同時反應(yīng)物會慢慢地解凍，并逐漸澄清，直至成為亮黃色溶液，恢復至室溫，繼續(xù)磁力攪拌反應(yīng)30 min，室溫減壓蒸餾，去盡過量的碘甲烷，然后用蒸餾水透析48 h，減壓蒸至2 mL左右，進行冷凍干燥，然后真空干燥5 h，再重復上述操作5次后，取少量樣品進行紅外檢測。

1.2.6.4 甲基化多糖水解和阿爾迪醇衍生物制備［12］

將已完全甲基化后的樣品溶于3 mL 90%的甲酸溶液中，密塞，100℃下水浴解聚6 h，減壓蒸干，加入2～3 mL甲醇，蒸干，重復三次以除盡過量的甲酸。然后向解聚后的樣品中加入4 mL 2 mol/L TFA，密封后110℃下水解3～4 h，反應(yīng)瓶中的溶液減壓蒸干，再加入2～3 mL甲醇，蒸干，重復三次以除盡過量的TFA。水解后的樣品用2 mL水溶解，加入20 mg NaBH4于室溫下反應(yīng)2 h，然后用冰醋酸調(diào)pH值至5左右，加1～2 mL甲醇及一滴冰醋酸再減壓蒸干，重復三次，以除盡過量的醋酸。于110℃下干燥10～15 min后，加入3 mL的醋酸酐，100℃下反應(yīng)1 h，減壓蒸去未反應(yīng)的醋酸酐，加入2 mL甲苯，減壓蒸干，如此重復三次以除盡醋酸酐。最后將乙?；蟮臉悠啡苡诼确?，再加入等體積的水洗滌氯仿層三次，除去水層，氯仿層加入無水硫酸鈉干燥，放置10 min，過濾，將氯仿溶液濃縮至0.1 mL左右，作氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)分析。

1.2.6.5 GC-MS分析條件:升溫方式為T=140 (3)-250/5。

2 結(jié)果與討論

2.1 單糖組成分析

幾種標準單糖按照保留時間從小到大分別是鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，它們在給定實驗條件下的保留時間分別為4.67、4.73、4.85、6.56、6.64和6.70 min，內(nèi)標物肌醇出峰時間為6.40 min。并且在4～7min范圍內(nèi)，各峰分離較好，基本無干擾現(xiàn)象。以標準單糖的保留時間為對照，采用糖醇衍生法對多糖樣品進行前處理后進行GC分析，從圖1中各個樣品峰的保留時間可以推斷1號、3號、4號峰分別為木糖(xyl)、葡萄糖(glc)和半乳糖(gal)的特征峰，它們的保留時間分別為4.83、6.62和6.69 min。內(nèi)標法得到這三種單糖的摩爾比為2.96∶1.25∶3.06，三種單糖的含量百分組成分別為38.11%、17.91%和43.98%，半乳糖含量最高。該研究結(jié)果與 Geresh(2002)和 Gloaguen (2004)的報道基本一致［5，4］，而與朱桂芳等［10］的研究結(jié)果紫球藻多糖由木糖、甘露糖、艾杜糖和葡萄糖組成有所不同。

圖1 紫球藻多糖的單糖組成氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of monosaccharides composition of EPS

圖2 紫球藻多糖的紫外掃描光譜Fig.2 Ultraviolet scan spectra of EPS

2.2 紫外光譜分析

紫球藻多糖的特征吸收波長位于220 nm，而在280 nm和260 nm波長處無吸收峰，表明樣品不含游離或裸露的蛋白質(zhì)和核酸(圖2)。

2.3 紅外光譜分析

圖3顯示的是紫球藻多糖的紅外分析光譜?？梢?，在3600～3200 cm-1處(3419.56 cm-1)出現(xiàn)一個較強的寬峰，為羥基(-OH)的伸縮振動;在3000～2800 cm-1處(2927.43 cm-1)出現(xiàn)的吸收峰較弱，為C-H的伸縮振動，1400～1200 cm-1處(1384.79 cm-1)的峰是C-H的變角振動。這兩組峰為多糖的特征吸收峰。1154～1022 cm-1范圍(1120.20 cm-1)為C-O的伸縮振動，1259 cm-1位置的峰是硫酸基的非對稱伸縮振動峰，931 cm-1附近的吸收峰是D-葡萄吡喃糖的環(huán)振動，該吸收峰較弱，說明為糖苷鍵類型為β構(gòu)型［3］。

圖3 紫球藻多糖EPS的紅外光分析光譜Fig.3 Infrared spectrogram of EPS

2.4 碘反應(yīng)

加入碘液后，糖液顏色沒有變化，說明多糖結(jié)構(gòu)中不含有連續(xù)的α(1→4)糖苷鍵結(jié)構(gòu)，也證明不含淀粉或測試樣品的空間結(jié)構(gòu)與淀粉有較大區(qū)別［3］。

2.5 部分酸水解

多糖部分水解后，使多糖大分子裂解成較小的片斷，適當控制實驗條件，可以使多糖的骨架結(jié)構(gòu)基本保持不變而使支鏈上或鏈末端的糖基水解下來。因此，進行部分酸水解(弱條件)，可用于推斷多糖的骨架結(jié)構(gòu)及分支結(jié)構(gòu)。

表1顯示的是在三種水解條件下，袋外組分、上清組分與沉淀組分各單糖組成的數(shù)據(jù)。通過對這些數(shù)據(jù)的分析可以得到以下幾個方面的推斷:

2.5.1 在1.0 mol/L的三氟乙酸TFA作用下，沉淀量很少，說明水解進行的較完全。

2.5.2 Gal在0.05 mol/L的TFA弱酸水解條件下，袋外含量下降幅度較大，而上清組分中相對含量最高，表明在支鏈或鏈末端有較大量的分布。

2.5.3 Glc在TFA濃度由0.5 mol/L提高到1.0 mol/L，水解條件加劇時，上清中含量增加，提示其有可能分布在主鏈或靠近主鏈的區(qū)域。

2.5.4 Xyl、Glc在沉淀中的含量相對穩(wěn)定，顯示其在主鏈或靠近主鏈區(qū)域可能有特定分布。

2.5.5 0.05 mol/L和0.5 mol/L TFA條件下，上清中各糖含量大體穩(wěn)定，說明被水解下來的支鏈和較長末端鏈的單糖分布可能比較均勻。

綜上所述，可以推斷 Xyl和Glc應(yīng)主要分布在主鏈或靠近主鏈區(qū)域，Gal在支鏈或鏈末端有較大量的分布。

表1 部分酸水解后各單糖的相對含量Table 1 Relative content of monosaccharides after mild hydrolysis with TFA

2.6 Smith降解及高碘酸氧化

高碘酸氧化是一種選擇性的氧化反應(yīng)，它只能作用于多糖分子中連二羥基及連三羥基處。當連二羥基的C-C鍵被斷開后，產(chǎn)生相應(yīng)的醛;當連三羥基的C-C鍵斷裂后，產(chǎn)生甲酸及相應(yīng)的醛。此反應(yīng)定量進行，每斷開1 mol C-C鍵，消耗1 mol高碘酸，由此可知，每生成1 mol甲酸必然對應(yīng)消耗2 mol高碘酸。因此，通過測定高碘酸消耗量及甲酸生成量，便可以判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分枝數(shù)目等［11］。

高碘酸氧化產(chǎn)物經(jīng)NaBH4還原，得到的多糖醇用稀酸在溫和條件下水解，可發(fā)生特異性降解，即Smith降解。Smith降解的特點是只打斷被高碘酸破壞的糖苷鍵，而未被高碘酸氧化的糖殘基仍連在糖鏈上。這樣，多糖醇經(jīng)Smith降解就可以得到小分子的多元醇和未被破壞的多糖或寡糖片段，對這些產(chǎn)物進行GC分析，便可以推斷出糖苷鍵的鍵型及其位置［11］。

根據(jù)以上的原理，對紫球藻多糖進行了高碘酸氧化和Smith降解，并對其降解物做了全面的分析，得到的以下主要結(jié)果:

2.6.1 甲酸的測定結(jié)果，以酚酞做指示劑，氧化液滴加一滴NaOH溶液之后，即溶液即變淺粉色，說明甲酸含量極少，因此推測多糖分子中可能存在1→2、1→6糖苷鍵，但含量極少;而高碘酸消耗量大于甲酸生成量的兩倍，說明可能存在1→2、1→2，6、1→4、1→4，6鍵型。

2.6.2 Smith降解之后，經(jīng)過透析，對袋外組分進行GC分析，檢測到甘油和赤蘚醇。檢出甘油，說明有產(chǎn)甘油鍵型，即1→2、1→6、1→2，6;檢出赤蘚醇，說明存在1→4或l→4，6等多種可氧化鍵型。但袋外組分未檢測出單糖組分，可能是因為上述可氧化鍵型含量少或分布在主鏈或靠近主鏈的區(qū)域，經(jīng)降解之后，只產(chǎn)生了少量的小分子片斷。

2.6.3 Smith降解之后，袋內(nèi)上清量多。經(jīng)GC檢測，袋內(nèi)上清和沉淀兩組分均檢測出Xyl、Glc及Gal。結(jié)合②袋外組分GC分析結(jié)構(gòu)，可以推斷糖鏈中能被高碘酸氧化的鍵型少，而抗氧化的鍵型多，即含有大量的1→3位鍵(1→3，6;1→2，3;1→3，4;1→2，3，4類似)。

綜合分析，紫球藻胞外多糖中糖苷鍵的連接方式主要為1→3，可能含有少量的1→6、l→2、l→4等鍵型。

2.7 核磁共振(NMR)分析

紫球藻多糖的1H NMR譜圖如圖4所示。其中4.7 ppm處是6-硫酸基-β-D-半乳糖C-1上H的化學位移;4.1 ppm處是6-硫酸基-β-D-半乳糖C-6上H的化學位移;3.6 ppm處是6-硫酸基-β-D-半乳糖C-2上H的化學位移。這三處化學位移表明樣品EPS的硫酸酯基團連在C-6上。

紫球藻多糖的13C NMR譜圖見圖 5。其中68.53 ppm處為β-(1→3)-D-半乳糖C-2的化學位移。這處化學位移表明樣品EPS含有以β-(1→3)糖苷鍵連接的D-半乳糖。由于紫球藻多糖樣品分子量大，溶解性較差且粘度太大，致使1H NMR和13C NMR獲得信息較少。但是樣品的1H NMR中基本所有峰的化學位移均小于5.0 ppm，且較為集中，表明多糖的糖苷鍵為β型，與紅外的結(jié)果一致。

圖4 EPS的1H NMR譜圖Fig.41H NMR of EPS

圖5 EPS的13C NMR譜圖Fig.513C NMR of EPS

2.8 甲基化和GC-MS分析結(jié)果

經(jīng)乙?；苌幚砗?，紫球藻多糖的水溶性大幅提高，達10 mg/mL，粘度明顯降低。可見，采用乙酰化方法衍生紫球藻胞外多糖，可明顯提高其水溶性，并可降低其粘度。

圖6顯示的是紫球藻多糖甲基化后，經(jīng)水解、還原、乙?；玫降募谆谴家宜狨パ苌锏腉CMS聯(lián)機分析?？梢?，紫球藻多糖出現(xiàn)了5個甲基化衍生物離子峰，其保留時間分別為 7.620，14.268，18.703，19.974，26.691 min。經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析它們分別為1，4-乙酰胺-3-氧-甲基-木糖，1-氧-乙?；?2，3，6-三氧-甲基-D-葡萄糖，1，4，6-三氧-乙?；?2，3-二氧-甲基-葡萄糖，(+)-甲基-半乳糖，D-半乳糖。

可以看出，紫球藻多糖EPS為一種主要含有1→3糖苷鍵，并含有1→4及1→6糖苷鍵的組成的雜多糖。

圖6 甲基化糖醇乙酸酯衍生物GC-MS分析譜圖Fig.6 GC-MS spectroscopy of methylated alditol acetated EPS

2.9 紫球藻多糖的重復單元結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

綜合2.1至2.8的分析結(jié)果，可以推斷紫球藻多糖EPS可能的重復單元為:

2.10 討論

多糖的組成分析一般采用氣相色譜法。由于樣品在氣相中傳遞速度快，可以選用廣泛的固定相和靈敏的檢測器，因而具有選擇性強、分辨力好、靈敏度高以及分析速度快等優(yōu)點［11］。采用氣相色譜法測定糖類，遇到的主要困難是糖類本身沒有足夠的揮發(fā)性，所以必須在氣相色譜分析之前預(yù)先轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)、對熱較穩(wěn)定的衍生物。目前常用的衍生物有糖的三甲基硅醚衍生物、糖肟三甲基硅醚衍生物、三氟乙酸酯衍生物、糖腈乙酸酯衍生物和糖醇乙酸酯衍生物等［11］，由于糖的異構(gòu)化，在某些衍生物的制備過程中，會產(chǎn)生衍生物的異構(gòu)體，使得色譜分析使每一種糖產(chǎn)生幾個峰，這往往影響組分的分離和定量。

在我們的前期研究中，對糖醇和糖腈乙酸酯兩種衍生方法的氣相分析效果進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖醇乙酸酯衍生化方法能較好地實現(xiàn)其水解產(chǎn)物的衍生，與糖腈乙酸酯衍生法相比，避免了衍生物異構(gòu)體的產(chǎn)生，每種糖都可以得到單峰且操作重復性強，適用于單糖的定量。此外，我們還注意到實驗過程中多糖的水解是糖醇和糖腈乙酸酯兩種衍物制備的關(guān)鍵，本研究采用2 mol/L三氟乙酸、120℃水解2 h的條件，可以將該多糖完全水解，避免了H2SO4水解多糖所帶來的溫度過高引起的爆管以及糖的炭化等問題，有效地縮短了水解時間。并且獲得的衍生產(chǎn)物經(jīng)減壓濃縮蒸干，干燥，二氯乙烷溶解后作GC分析，得到的色譜峰未出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

NMR用于多糖結(jié)構(gòu)分析時，通常會因為多糖的高分子量而得不到更多的信號，本研究中為了獲得更多地信息，將多糖樣品進行進行了部分酸水解處理，但是仍然沒有獲得理想的結(jié)果;但是加大多糖的濃度(一般不低于5%)和升高溫度可以提高分辨率，獲得更多的信號峰。

多糖的甲基化分析是測定多糖分子中各單糖糖苷鍵連接位置的權(quán)威方法之一，但是多糖高的分子量會帶來甲基化不完全的問題，影響最終結(jié)果的分析;此外，多糖大分子的空間折疊及分子內(nèi)氫鍵的存在造成空間位阻使甲基化不完全［3］。本研究中，由于紫球藻多糖的分子量高達2.91×106Da，且水溶性較差，給甲基化實驗帶來很大的困難。將多糖乙?；幚砗螅行У母纳屏似淙芙舛?，由于乙?；诤罄m(xù)實驗中會自動脫落，不會對實驗造成影響。即便如此，由于試驗條件的苛刻與本身實驗條件的有限，再加上樣品本身的大分子量都使甲基化進行的不完全，從而影響了實驗結(jié)果的準確度，導致GCMS分析中無法給出更多的信息。因此，要想獲得更多的紫球藻多糖的完整的糖鏈結(jié)構(gòu)，還需克服上述實驗中的一些不足，借助更多的儀器分析，如比旋光儀、多維NMR、掃描電鏡法(SEM)、小角度X衍射法(SAXS)、多維MS方法等。

3 結(jié)論

3.1 GC分析結(jié)果表明紫球藻多糖主要由木糖、葡萄糖和半乳糖組成，它們的摩爾比為2.96∶1.25∶3.06，三種單糖的含量百分組成分別為38.11%、17.91%和43.98%，半乳糖含量最高。

3.2 IR分析表明紫球藻多糖具有多糖的特征吸收峰，為硫酸化多糖，且提示有β-D-葡萄吡喃糖存在; 1H NMR表明樣品EPS的硫酸酯基團連在C-6上，半乳糖存在形式為6-硫酸基-β-D-半乳糖;13C NMR數(shù)據(jù)表明樣品中D-半乳糖以β-(1→3)糖苷鍵連接。

3.3 碘反應(yīng)顯示糖鏈不含有連續(xù)的α(1→4)糖苷鍵;部分酸水解推斷出Gal在支鏈或鏈末端有較大量的存在，Xyl和Glc在主鏈或靠近主鏈區(qū)域有特定分布;通過高碘酸氧化和Smith降解反應(yīng)后單糖組成的變化，推斷出糖鏈中存在大量的1→3型等抗高碘酸氧化的糖苷鍵，可能含有少量的1→6、l→2、l→4等鍵型;經(jīng)甲基化后經(jīng)GC-MS分析表明該衍生物為木糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，連接方式主要有1→3糖苷鍵，并含有1→4及1→6糖苷鍵。

1 Zhuge J(諸葛健)，Zhao ZF(趙振鋒).Fang HY(方慧英).The relationship between structure and function of polysaccharides.J Wuxi Univ Light Ind(無錫輕工大學學報)，2002，21:209-212.

2 Sheng SQ，Chermiak R.Structure of the capsular polysaccharide ofClostridium perfingensHobbs 10 determined by NMR spectroscopy.Carbohydr Res，1998，305:65-72.

3 Guo ZC(郭振楚).Sugar chemistry(糖類化學)Beijing: Chemistry Industry Press，2005.

4 Gloaguen V，Ruiz G，Morvant H，et al.The extracellular polysaccharide ofPorphyridiumsp.:an NMR study of lithium-resistant oligosaccharidic fragments.Carbohydr Res，2004，339: 97-103.

5 Geresh S，Adin I，Yarmolinsky E，et al.Characterization of the extracellular polysaccharide ofPorphyridiumsp.:molecular weight determination and rheological properties.Carbohydr Polym，2002，50:183-189.

6 Huheihel M，Ishanu V，Tal J，et al.Activity ofPorphyridiumsp.Polysaccharide against herpes simples viruses in vitro andin vivo J Biochem Bioph methods，2002，50:189-200.

7 Sun LQ，Wang CH，Shi QJ，et al.Preparation of different molecular weight polysaccharides fromPorphyridium Cruentumand their antioxidant activities.Int J Biol Macromol，2009， (45):42-47.

8 Irit D，Renven C，UrielSod M.et al.Solube polysaccharide and biomass of red microalgaPorphyridiumsp.alter intestinal morphology and reduce serum cholesterol in rats.British J Mutri，2000，184:469-472.

9 Gu NY(顧寧琰)，Liu YF(劉宇峰).Antiirradiation activities of extracellular polysaccharide ofPorphyridiumsp.Mar Sci(海洋科學)，2002，26(12):53-56.

10 Zhu GF(朱桂芳)，Wei D(魏東)，Liu SS(劉石生)，et al.Seperation，Purif ication and Property of Extracellular Polysaccharide fromPorphyridiumsp.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2005，17:542-548.

11 Zhang WJ(張惟杰).Study on Biochemistry Technology of Glycoconjugates(糖復合物生化研究技術(shù))，2st Ed.Hangzhou:Zhejiang University Press，2003，36-242.

12 Liu CH(劉純慧)，Ye L(葉亮)，Lin QX(林親雄)，et al.Studies on preparation and antitumor activity of the polysaccharide from the eggs ofStrongylocentrotus nudus(SEP).Pharm Biotechnol(藥物生物技術(shù))，2006，13:429-432

Analysis of Chemical Structures of Polysaccharide from Porphyridium Cruentum

SUN Li-qin1，2*，WANG Ling1，MA Cui-hua1，WANG Chang-hai2

1Life science college of Yantai University，Yantai 264005，China;2Bioscience and Engineering department of Dalian university of Technology，Dalian 116024，China

In this paper，the chemical analysis and spectrum analysis methods were used for investigating the level 1 sugar chain structure ofPorphyridium Cruentumpolysaccharide(EPS).The results of GC analysis showed that the sugar moiety of this polymer EPS was composed of three neutral monosaccharides(xyl，glc and gal)，and molar ratio was 2.96∶1.25∶3.06.Infrared spectrum analysis showed that EPS was sulfuric acid ester polysaccharide，and its absolute configuration was β.The results of chemical analysis revealed that the main linkage of EPS was β-(1→3)，and there were a few of 1→4 and 1→6 linkages.A large of galactoses exsited at the end or branch of sugar chain，but xylose and glucose were distributed specially close to main chain.NMR analysis displayed that sulfuric acid ester linked on C-6，and glycosidic bond was β-configuration.GC-MS on-line analysis further confirmed that EPS was a heteropolysaccharide，and sugar chains structure mainly contained 1→3 linkage and small number of 1→4，1→6 linkage.Based on above comprehensive analysis，the repeat units of polysaccharide produced by P.cruentum could be inferred as D-Xyl and D-Glc，which were present at the main chain with β-(1→3，1→4)linkage and D-Gal mainly existed at the end of main chain and branched chain.

Porphyridium cruentum;polysaccharide;sugar-chain structure;chemical analysis;spectrographic analysis

Q539

A

1001-6880(2012)05-0569-07

2011-07-05 接受日期:2011-12-06

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2008BAD94B04);山東省自然科學基金項目(Y2007D59，Y2008B21);煙臺市科技發(fā)展計劃項目(2009219)

*通訊作者 E-mail:sliqin2005@163.com