高效液相色譜法測(cè)定一次性使用輸液器中DEHP溶出量

劉曦 于晶晶 王紅 劉嘉馨 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 輸血研究所 （成都 610052）

高效液相色譜法測(cè)定一次性使用輸液器中DEHP溶出量

劉曦 于晶晶 王紅 劉嘉馨
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 輸血研究所 （成都 610052）

以乙醇水溶液作為浸提液，模擬臨床使用條件，建立高效液相法（HPLC）測(cè)定一次性使用輸液器中鄰苯二甲酸二（2-乙基）己基酯（DEHP）溶出量的方法，為制定聚氯乙烯（PVC）醫(yī)療器械產(chǎn)品中增塑劑DEHP溶出量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一次性使用輸液器 HPLC 增塑劑 DEHP

1. 前言

鄰苯二甲酸二（2-乙基）己基酯（DEHP）是聚氯乙烯（PVC）類(lèi)一次性使用輸液器中最具代表性的增塑劑，被廣泛使用。DEHP與PVC分子之間僅以范德華力和氫鍵相連，在臨床使用過(guò)程中，DEHP會(huì)從PVC輸液器中遷移出來(lái)，伴隨藥物輸注進(jìn)入人體。近年相關(guān)研究表明，DEHP具有慢性毒性[10~11]，人體內(nèi)的長(zhǎng)期累積會(huì)影響肌肉骨骼系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1]、肝臟組織[2]，特別是男性生殖健康[3]。因此，美國(guó)FDA在其發(fā)表的關(guān)于DEHP增塑PVC醫(yī)療器械安全性評(píng)價(jià)的研究報(bào)告[4]中，提出要重視和監(jiān)控醫(yī)療器具中DEHP的釋放。鑒于此，本文建立了測(cè)定一次性PVC輸液器中DEHP溶出量的高效液相色譜法（HPLC)。

2. 材料與方法

2.1 試劑與儀器

95%乙醇（成都科隆化學(xué)試劑公司，AR），甲醇（國(guó)藥化學(xué)試劑公司，色譜純），DEHP標(biāo)準(zhǔn)品（山東宏信化工股份有限公司，純度≥99.5%），純水/超純水系統(tǒng)（美國(guó)Pall，Cascada），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA，RV10），紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman，DU800），高壓液相色譜（美國(guó)Waters，e2695-2489），國(guó)產(chǎn)一次性使用輸液器（批號(hào)：20110511 09）。

2.2 浸提液的制備

按照GB14232.1-2004中醇溶出物測(cè)定要求，用95%乙醇和超純水，通過(guò)液體比重天平測(cè)定并配制2000m L密度為(0.9373~0.9378)g/m l的乙醇水混合液作為浸提液。

2.3 色譜條件

檢測(cè)器：紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)n=272nm；色譜柱：Sunfire C18，5.0 μm，4.6mm×150mm；柱溫：室溫；流動(dòng)相：甲醇（色譜純）；流量：1.0m l/m in；進(jìn)樣量：5μl。

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 DEHP 特征吸收波長(zhǎng)的選擇

精密稱(chēng)取DEHP標(biāo)準(zhǔn)品 2.0010 g，用甲醇稀釋至100m l，得到濃度為20.01 m g/m l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋 200倍，得到0.10mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)在190nm~1100nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，根據(jù)吸收光譜曲線確定HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)（n）。

2.4.2 DEHP保留時(shí)間的確定

取DEHP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋得到一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在2.3色譜條件下進(jìn)樣測(cè)量，得到DEHP的出峰保留時(shí)間。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取DEHP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)玫?001ug/m l~5ug/m l濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.3中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到各濃度的峰面積值。 以峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，DEHP濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到線性回歸方程。

2.4.4 靈敏度試驗(yàn)

取DEHP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)玫揭幌盗袧舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照2.3 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將信噪比≥100的最小DEHP濃度定為定量檢測(cè)限。

2.4.5 精密度試驗(yàn)

取DEHP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)玫綕舛葹?1500 μg/m l~5 μg/m l的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每種濃度樣品連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，得到其峰面積，計(jì)算變異系數(shù)（RSD），進(jìn)行測(cè)量值的精確度表征，考察結(jié)果重復(fù)性。

2.4.6 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確吸取3份浸提液各1m l，與濃度分別為2000ug/m l、1000ug/m l、500ug/m l 各1m l DEHP標(biāo)準(zhǔn)工作液均勻混合，得到高、中、低三種濃度的加標(biāo)回收樣品溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，冷卻至室溫，殘余物用4m L甲醇渦旋溶解后得到樣品檢驗(yàn)液，靜置數(shù)分鐘后吸取上清，按2.3色譜條件對(duì)每個(gè)加標(biāo)回收樣品檢驗(yàn)液測(cè)定3次，計(jì)算回收率（%）和變異系數(shù)（RSD）。

2.5 供試液的制備及測(cè)定

將配制好的乙醇水浸提液用膠塞玻璃瓶分裝（500m l/瓶，共4瓶，），懸掛于輸液架上，取出輸液器樣品，模擬臨床操作和條件，調(diào)節(jié)流速在2.5~3.0m l/m in范圍內(nèi)（流速上限），收集全部流出液作為供試液1；重復(fù)上述操作，調(diào)節(jié)流速在0.5~1.0m l/m in范圍內(nèi)(流速下限)，依次對(duì)每瓶浸提液進(jìn)行輸注，收集全部流出液作為供試液2。

將上述供試液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，冷卻至室溫，殘余物用4m L甲醇渦旋溶解后得到樣品檢驗(yàn)液，靜置數(shù)分鐘后吸取上清，按2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定得到峰面積值，將其代入相應(yīng)線性回歸方程即得DEHP濃度（C，ug/m l），按下式換算每套輸液器的DEHP溶出量（M，mg/套）：

3.結(jié)果與討論

3.1 DEHP 特征吸收波長(zhǎng)的確定

如圖1所示，DEHP在190nm處有飽和鍵（C-C）吸收峰、202~238nm處有不飽和鍵（C=C、C=O）和雜原子飽和鍵（C-O-C）的吸收峰，在272nm處有苯環(huán)特征吸收峰。因此，以272nm作為HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 DEHP 出峰保留時(shí)間

見(jiàn)圖2。

3.3 供試液制備方法的選擇

已有不少研究[2~3],[5~8]對(duì)供試液的制備采用的是截取產(chǎn)品某一部分，對(duì)其進(jìn)行浸泡和萃取的方式。這種方法在產(chǎn)品的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)方面是可行的[5~8]，但通過(guò)這種方法測(cè)得的DEHP溶出量卻難以反映產(chǎn)品臨床實(shí)際使用時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)[2~3]，因?yàn)楫a(chǎn)品使用時(shí)與浸提液的接觸是動(dòng)態(tài)過(guò)程，而浸泡方法是靜態(tài)過(guò)程，這兩種浸提過(guò)程對(duì)DEHP的浸提能力會(huì)有較大區(qū)別。另外，產(chǎn)品使用時(shí)與浸提液的接觸是整個(gè)內(nèi)腔而不是局部，所以局部浸提的結(jié)果不能反映產(chǎn)品使用的真實(shí)情況。因此本研究采用模擬臨床使用條件的供試液制備方法。

再者，輸液藥物分為晶體液類(lèi)（生理鹽水、葡萄糖等）和脂類(lèi)藥物。已有安全性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示[12]，DEHP在與晶體液接觸時(shí)溶出極少，其進(jìn)入人體的含量對(duì)人體幾乎沒(méi)有危害。而DEHP與脂類(lèi)藥物接觸時(shí)卻容易溶出。所以我們只針對(duì)一次性使用輸液器輸注脂類(lèi)藥物時(shí)DEHP溶出量進(jìn)行研究。乙醇水溶液是脂類(lèi)溶劑，可替代脂類(lèi)藥物作為本研究的溶出檢測(cè)液。

同時(shí)針對(duì)一次性使用輸液器的使用要求，流速一般為0.5m l/m in~3m l/m in，本研究分別選擇了0.5~1.0m l/m in和2.5~3.0m l/m in兩種流速，全面考察此產(chǎn)品的DEHP溶出量。

3.4 DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

由圖3可知，線性回歸方程1：Y = 828.32X +22000，相關(guān)系數(shù)r=0.9986，結(jié)果顯示DEHP濃度在2001ug/m l~5ug/m l范圍內(nèi)與其峰面積值線性關(guān)系良好。

由于2001ug/m l~5ug/m l的線性相關(guān)范圍較寬，在確定一次性輸液器中DEHP溶出量時(shí)會(huì)存在較大誤差，因此把整個(gè)濃度范圍劃分為高、低2個(gè)濃度等級(jí)，即2001ug/m l~100ug/m l和250ug/m l~5ug/m l，分別在各自范圍內(nèi)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，如下：

圖1 . DEHP吸收光譜（190nm~400nm）

圖2 . DEHP 的HPLC 保留時(shí)間

圖4、圖5顯示，線性回歸方程2：Y = 804.71X+53814，相關(guān)系數(shù)r = 0.9982；線性回歸方程3：Y = 924.42X + 5588.6，相關(guān)系數(shù)r = 0.9991。結(jié)果顯示DEHP濃度在2001ug/m l~100ug/m l和250ug/m l~5ug/m l范圍內(nèi)與其峰面積值線性關(guān)系良好。

3.5 方法靈敏度

由表2可知，本方法的DEHP定量檢測(cè)限為0.5ug/m l。

3.6 方法精密度

見(jiàn)表3，RSD均＜5%，表明此方法在較寬的線性范圍內(nèi)具有良好的精密度。

3.7 加標(biāo)回收率結(jié)果

圖3 . DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線1（濃度范圍：2001ug/m l~5ug/m l）

圖4 . DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線2（濃度范圍：2001ug/m l~100ug/m l）

圖5 . DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線3（濃度范圍：250ug/m l—5ug/m l）

表1 . DEHP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)應(yīng)峰面積值

表2 . 信噪比臨界100的DEHP標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度

表3 . 精密度試驗(yàn)結(jié)果

加標(biāo)回收率測(cè)定考察的是供試液制備和處理以及儀器測(cè)試過(guò)程中待測(cè)目標(biāo)物的前處理情況，以此來(lái)衡量測(cè)試方法的可行性。回收率一般在90%~110%之間比較合適[9]。結(jié)果見(jiàn)表4，本方法回收率均在98%~103%之間，RSD均＜5%，說(shuō)明采用的測(cè)量方法準(zhǔn)確度高，精確度好。

3.8 一次性使用輸液器樣品DEHP溶出量測(cè)定

見(jiàn)圖6、圖7，由樣品檢驗(yàn)液1和2的 DEHP色譜圖及其峰面積，對(duì)比DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線，認(rèn)為較適用的是2001ug/m l~100ug/m l范圍內(nèi)的線性回歸方程2，據(jù)此計(jì)算出樣品檢驗(yàn)液1和2中的DEHP濃度（n=3），見(jiàn)表5。

表4 . DEHP 加標(biāo)回收率和精密度

圖6 . 樣品檢驗(yàn)液1 中DEHP色譜圖例

圖7 . 樣品檢驗(yàn)液2 中DEHP色譜圖例

表5 . 樣品檢驗(yàn)液中DEHP含量測(cè)定結(jié)果

以2.5~3.0m l/m in的流速用此一次性使用輸液器進(jìn)行輸注，在本試驗(yàn)條件下每套產(chǎn)品DEHP溶出量（mg）為：524.52×4/1000=2.10

以0.5~1.0m l/m in的流速用此一次性使用輸液器進(jìn)行輸注，在本試驗(yàn)條件下每套產(chǎn)品DEHP溶出量（mg）為：813.89×4/1000=3.26

DEHP的溶出量與浸提液的接觸時(shí)間成正比。2.10mg的溶出量是在臨床輸注流速上限的情況下測(cè)得，浸提液與輸液器的接觸時(shí)間較短，可視為最小溶出量；而3.26g的溶出量是在臨床輸注流速下限的情況，浸提液與輸液器的接觸時(shí)間較長(zhǎng)，屬于極限浸提，可視為最大溶出量。所以，此一次性使用輸液器在臨床使用輸注脂類(lèi)藥物時(shí)的DEHP溶出量應(yīng)在2.10mg~3.26mg之間。這個(gè)數(shù)值范圍可作為本類(lèi)產(chǎn)品DEHP風(fēng)險(xiǎn)分析的參考數(shù)據(jù)。

4.結(jié)論

本試驗(yàn)證明，高效液相色譜法（HPLC）在2000ug/m l~5ug/m l的較寬DEHP濃度范圍保持良好的線性關(guān)系。不同規(guī)格、不同廠家的一次性使用輸液器以及不同類(lèi)型的PVC醫(yī)療器械產(chǎn)品，在臨床使用過(guò)程中DEHP溶出量可能相差較大，HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的較寬線性范圍則能很好地適應(yīng)產(chǎn)品特點(diǎn)，有利于確保檢測(cè)的可靠性。同時(shí)精密度和回收率試驗(yàn)也表明此方法準(zhǔn)確度高、精確度好且操作簡(jiǎn)單、分析快速，易于推廣。

在我國(guó)的醫(yī)療器械分類(lèi)監(jiān)管中，其相關(guān)的國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中并沒(méi)有針對(duì)臨床實(shí)際使用條件下PVC醫(yī)療器械產(chǎn)品中的DEHP溶出指標(biāo)的限量要求和統(tǒng)一方法。因此，為更好地保護(hù)患者的身體健康，應(yīng)盡可能地在相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)上體現(xiàn)這一點(diǎn)。

[1] 胡曉宇,張克榮,孫俊紅等. 中國(guó)環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物污染的研究. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2003, 13 (1) : 9.

[2] 鄭滌新，耿媛媛，王婕等. 導(dǎo)管類(lèi)醫(yī)療器械DEHP檢測(cè)方法辨析.化學(xué)工程與裝備， 2010,6:175-176.

[3] 唐云華, 麥偉忠, 曾戎等. 體外循環(huán)管道PVC增塑劑浸出量的測(cè)定及對(duì)比. 廣州化工, 2011, 39(8):92-93.

[4] US FDA(2002): Safety assessment of di(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP) released from PVC medical devices[R].

[5] 印暉，金念祖。 紫外分光光度法測(cè)定一次性使用體外循環(huán)管道中DEHP溶出量. 藥物鑒定, 2006，15（14）：9—10.

[6] 葛海生，劉元瑞，汪 杰. 氣相色譜法測(cè)定PVC輸液袋中DEHP的含量. 武警醫(yī)學(xué), 2006，17: 97-98.

[7] 周志明，毛明英，周 冕. PVC制品中增塑劑DEHP含量的測(cè)定. 塑料科技, 2008，36（11）：82-85.

[8] 朱九群, 蘭婉玲, 張羅紅. HPLC測(cè)定PVC輸液袋中的鄰苯二甲酸二(2 - 乙基己基)酯. 華西藥學(xué)雜志, 2009，24（3）：318-319.

[9] KUMAR N, VERMA N, SONGH O, et al. Estimation of A tenolol by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography. Journal of Chemistry. 2010, 7(3): 962- 966.

[10] H. M. Koch, R. Preuss, J. Angerer. Di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP): human metabolism and internal exposure – an update and latest results. International Journal of Andrology. 2006, 29(1): 155-165.

[11] Holger M Koch, Bernd Rossbach, Hans Drexler, et al. Internal exposure of the general population to DEHP and other phthalates—determination of secondary and primary phthalate monoester metabolites in urine. Environmental Research. 2003, 93(2):177-185.

[12] 奚廷斐 王春仁. 鄰苯二甲酸二異辛酯增塑聚氯乙烯醫(yī)療器械的安全性評(píng)價(jià). 《中國(guó)醫(yī)療器械信息》2005, 11(2): 27-30.

參考文獻(xiàn)

[1] GB 9706.1-2007 《醫(yī)用電氣設(shè)備 第1部分：安全通用要求》

[2] YY 0649-2008 《高電位治療設(shè)備》

Determ ination of DEHP Released from Transfusion Instrum en t for Single Use by HPLC

LIU Xi YU Jing-jing WANG Hong LIU Jia-xin
Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Sciences (Chengdu 610052)

We used ethyl alcohol-water as leaching medium, simulating clinical operation, to develop the HPLC for determination of DEHP released from transfusion instrument for single use, in order to give the experimental foundation for establishing the test standard of the plasticizer DEHP release of PVC medical instrument. Key words: transfusion instrument for single use, HPLC, plasticizer, DEHP

1006-6586(2012)05-0029-06

R197.39

A

2011-12-02

劉曦，實(shí)習(xí)研究員；王紅，通訊作者，助理研究員