實時熒光定量PCR儀原理與技術關鍵點分析

鄭沁春 福建省立醫(yī)院設備科 （福州 350001）

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種在體外模擬體內DNA復制的核酸擴增技術，以少量的DNA分子為模板，經過變性-退火-延伸的多次循環(huán)，以接近指數(shù)擴增的形式產生大量的目標DNA分子[1]。由Mullis在1983年建立的PCR方法已成為分子生物學及其相關領域的經典實驗方法[2]。能夠提供PCR反應條件，自動完成PCR反應的儀器就叫做PCR儀[3]。近年來，該技術本身獲得長足發(fā)展，可靠性不斷提高，其中以實時熒光定量PCR技術的方法應用最為廣泛，已成為分子生物學研究的基本技術平臺，通過此技術平臺開展的基因表達分析、基因檢測、SNP（單核苷酸多態(tài)性）基因分型、基因突變掃描、染色體易位分析病毒載量分析、MicroRNA表達分析和CHIP等多種研究已取得了眾多成果，得到了國際相關領域專業(yè)人士的認可[4]。

1.實時熒光定量PCR原理

圖1. Ct值與起始模板濃度的關系

所謂實時熒光定量PCR技術（Real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR），是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[5]。該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成3個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化[6]。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，根據最終的 PCR 產物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。

為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR 技術中有個非常重要的計算工具：Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)[7]。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系[8]，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值（如圖1所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

2.實時熒光定量PCR儀的工作部件及工作測量原理

熒光定量PCR系統(tǒng)由熱循環(huán)系統(tǒng)、激發(fā)光源及檢測部件組成。由于熱循環(huán)系統(tǒng)控制著DNA的解鏈延伸，因此是熒光定量PCR儀最為關鍵的技術部位，目前實驗室常用的PCR 儀按熱循環(huán)系統(tǒng)大致可分為水浴式、氣流式和半導體式3種[9]。其中應用最廣的是半導體式PCR 儀，其熱循環(huán)系統(tǒng)結構如圖2所示。半導體制冷片均勻地串聯(lián)平鋪，用以加熱制冷，其上方為一帶96 孔的金屬塊基座，為保證基座各孔的溫度均勻，其下方緊貼一塊散熱片并安裝風扇。通常在制冷片與基座和散熱片之間的接觸面上均勻涂抹一層薄的導熱膠，以減小熱阻[10]。

2.1 PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)的硬件研究與設計

圖2. 半導體PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)示意圖

PCR加熱系統(tǒng)有幾種方案，他們的輸出波形如圖3所示。圖3(a)為交流輸出調相調壓(或移相調壓)方案。需要雙向晶閘管，移相觸發(fā)電路等環(huán)節(jié)。單片機控制雙向晶閘管的導通角，從而改變輸出到加熱絲的交流電壓有效值大小，達到改變加熱功率的目的。如圖中T2階段的交流有效電壓U2比T1的U1大。圖3(b)是在圖3(a)的電路基礎上，增加整流和濾波環(huán)節(jié)得到可調直流輸出的大小。圖3(c)是將交流電全波整流輸出，輸出為脈動流，調整其幅度，從而調整其平均直流輸出的大小。這3種方案，單從加熱角度看是沒有問題的，但從升降溫時控制響應速度和對生化反應的電磁脈沖干擾角度考慮，都存在一定的問題。

圖3. 四種功率輸出驅動電路輸出波形比較

圖4.方案(d) 的原理示意圖

圖5. 3種控溫算法

圖3(d)方案的電路如圖4所示。單片機通過INT0感知交流電的零點，由PL0輸出控制信號，并經過零信號同步輸入給OC門75452，75452控制固態(tài)繼電器來調節(jié)輸出給加熱絲的交流電周波個數(shù)。最大輸出周波個數(shù)為50Tc。例如，控制周期為Tc=10s，則在一個控制周期內，零碼輸出零個周波(無)，半碼輸出250個周波，全碼輸出500(50×10)個周波等等。而且是整周波輸出(零點導通，零點截止)，不會是畸形的非整周期非正弦波形輸出。輸出可在0到500(50Tc)個周波之間調整，如圖3(d)所示，該方案電路簡單， 時間響應快，零點觸發(fā)無干擾。在軟件配合下，可以完成預定設計任務。

2.2 PCR儀溫度控制算法

PCR儀除了合理設計硬件電路之外，還需要在軟件算法上仔細研究、合理設計才能很好地完成PCR 的控溫任務，一般的PID控制效果如圖5中曲線1所示。由于積分飽和作用，使得控制結果具有很大的超調，而且上升沿也不迅速。圖5中曲線2 所示為采用積分分離算法的控制效果。該算法是在未進入±∈的誤差限制范圍(誤差帶)內不進行積分，進入±∈的誤差帶內才開始積分。雖然沒有超調，但是上升沿速度太慢，以上兩種算法都存在兩個方面的問題：一是PID的整定參數(shù)不能隨情況的變化而變化(不具有參數(shù)自整定功能)；二是它們均將風扇的速度恒定不變，而僅僅去改變加熱器產生的熱量。屬于單參數(shù)控制，不能得到雙參數(shù)聯(lián)合控制的效果。圖5曲線3所示為采用分段積分變風速雙參數(shù)控溫算法，考慮同時使用調節(jié)加熱量和改變風扇風速的策略，并具有參數(shù)自整定功能。

3.激發(fā)及檢測部件的質量控制及測量

熒光定量PCR儀都是使用熒光化學檢測法[11]，可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：

3.1 TaqMan熒光探針

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團[12]。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。

3.2 SYBR熒光染料

在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

4.影響熒光定量PCR儀高精密的其他因素

操作規(guī)范影響著測量結果，特別是在DNA抽提的時候，如果DNA被污染或者降解將會顯著影響檢測結果。其次引物設計也尤為關鍵，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算最合適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷，經驗公式得到的數(shù)據不一定能“P”出來結果，細微的變化對結果都可能產生決定性的影響，因而反復“摸條件”對測量結果顯得尤為重要。在實驗反應過程中，試劑的使用也是極為關鍵的步驟，對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要[13]，因為Taq和校正酶的最佳反應溫度可能有顯著差異。

5.小結

由以上介紹，我們可以知道實時熒光定量PCR的出現(xiàn)克服了傳統(tǒng)PCR技術普遍存在的假陽性及不能定量等問題，使得PCR技術更廣泛地應用于臨床及其藥物方面，目前已經在腫瘤研究、乙肝診斷、病毒檢測、動物疾病檢測與防御、藥物療效的評價與考核等方面，為臨床理論研究、治療疾病和藥物開發(fā)提供了客觀的物質基礎。實時熒光定量PCR具有范圍寬、敏感性高、精確度高和無PCR后處理步驟，避免了交叉污染，產出率高，可以進行多重檢測的優(yōu)點，使得其在基礎研究和分子診斷領域受到青睞，成為當今研究mRNA表達水平最熱門的技術之一，是迄今為止定量最準確、重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認，其應用領域將越來越廣泛。

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