轉化生長因子β1降低大鼠自發(fā)性癲癇發(fā)作并抑制膠質細胞活化*

韓遠遠， 劉益民， 王 玉

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經內科，安徽合肥230022)

癲癇是一種以自發(fā)性發(fā)作為主要特征的常見神經系統(tǒng)疾病，大約影響0.5% ～2%的人群。顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是人類最常見的癲癇類型，TLE的發(fā)生進程通常包括3個階段:由最初的腦損傷事件(如腦缺血，感染，腫瘤，創(chuàng)傷性腦損傷等)引起(急性期)，進而促使腦細胞、組織和結構的改變(沉默期)，最終引起促癲癇環(huán)路重建導致自發(fā)性反復性驚厥的發(fā)生(慢性期)［1］。目前最常用的TLE動物模型是通過系統(tǒng)注射匹羅卡品(pilocarpine，Pilo)引起癲癇持續(xù)狀態(tài)，進而引發(fā)一系列促癲癇事件的改變，最終引起慢性自發(fā)性癲癇的發(fā)作［2］。

轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF－β1)作為多效性的因子，在缺血性腦損傷中已被證實具有控制細胞的生長、分化、轉移，以及抗氧化、調節(jié)炎癥反應和阻止細胞凋亡的作用，對興奮毒性、化學毒性、缺氧等引起的神經元損傷具有直接保護功效［3－5］。作為內源性免疫細胞，小膠質細胞和星形膠質細胞對腦新陳代謝、細胞外離子的動態(tài)平衡、血腦屏障的完整性、免疫功能及保護神經元的正常功能起到至關重要的作用，同時膠質細胞的激活為TLE的一個重要特征，激活的膠質細胞會出現(xiàn)結構和功能的改變，這些改變可以促進慢性期自發(fā)性驚厥的發(fā)生［6－7］，所以激活的膠質細胞既是癲癇的結果又是促進其原因。實驗研究表明左乙拉西坦的抗癲癇作用是通過增加TGF－β1的分泌，經TGF－β1介導而實現(xiàn)的［8］，但是其抗癲癇具體機制尚不確切，因此本實驗通過Pilo建立大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，通過滴鼻給予TGF－β1，進一步驗證其抗癲癇作用，并探討TGF－β1可能的抗癲癇機制及神經保護作用。

材料和方法

1 動物

選用成年健康雄性 SD大鼠，220～250 g，SPF級，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。置于安靜、避光、自由攝取食水的室溫環(huán)境下飼養(yǎng)2周，以適應環(huán)境。

2 主要試劑

重組人TGF－β1蛋白購自Peprotech，Pilo及東莨菪堿購自Sigma，免疫組化用小膠質細胞標志物——離子鈣結合接頭分子1(ionized calcium－binding adaptor molecule 1，Iba1)多克隆兔抗購自Wako，膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體購自北京博奧森公司。

3 主要方法

3.1 動物模型的建立 腹腔注射(ip)東莨菪堿1mg/kg以拮抗外周膽堿反應，30 min后，大鼠給予新鮮配制的Pilo 320 mg/kg ip，每30 min追加30 mg/kg直至癲癇持續(xù)狀態(tài)出現(xiàn)。正常對照組給予同劑量的生理鹽水注射。注射15 min后觀察大鼠行為，癲癇發(fā)作嚴重程度根據(jù)Racine標準進行分級:Ⅰ級:面部陣攣，包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等;Ⅱ級:Ⅰ級加節(jié)律性點頭;Ⅲ級:Ⅱ級加前肢陣攣;Ⅳ級:Ⅲ級加后肢站立;Ⅴ級:Ⅳ級加摔倒或伴全身性陣攣發(fā)作。本研究以發(fā)作達4或5級癇性發(fā)作為誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)成功的標準。出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠，自出現(xiàn)驚厥性癇性發(fā)作后50 min，給予10%水合氯醛350 mg/kg ip終止發(fā)作。

3.2 TGF－β1滴鼻及實驗分組 建立癲癇持續(xù)狀態(tài)模型前24 h對實驗組大鼠給予滴鼻處理。重組蛋白TGF－β1(Pepro－Tech)溶于無菌PBS液中，使其濃度達到50 mg/L。具體給藥方法如下:大鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉后，取仰臥位，并將頭頸背用4 cm×4 cm的紗布卷稍稍墊高以有利于藥物進入后鼻腔。應用滴鼻器經鼻均速滴入20 μL TGF－β1(每只1 μg)，兩側鼻腔交替滴入，平均每只大鼠滴鼻用時約15 min。Pilo和正常對照組應用相同方法給予等容量的PBS溶液。

3.2.1 實驗一 癲癇模型建立后7 d，通過12 h視頻觀察大鼠自發(fā)性癲癇活動，28 d時結束。

3.2.2 實驗二 膠質細胞免疫組化大鼠分別于建模后1、7、14、28 d取材。尼氏染色14 d取材。每組每個時點大鼠數(shù)量為5只。

3.3 動物取材及固定 實驗動物分別在癲癇持續(xù)狀態(tài)后1 d、7 d、14 d及28 d行斷頭取腦。大鼠腹腔麻醉后固定，開胸經升主動脈插管，0.9%氯化鈉注射液100 mL快速灌注以沖凈血液，后用4%多聚甲醛100 mL先快后慢灌注固定全身，后斷頭取腦，固定于4%多聚甲醛中48 h，流水沖洗標本18 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片以觀察海馬，厚6 μm，每隔5張取1張，共收集6張，進行染色處理。

3.4 免疫組化 切片常規(guī)脫蠟至水，按SABC法進行免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片后鏡檢。陰性對照實驗:免疫組化染色過程中以0.02 mol/L PBS代替GFAP和Iba1蛋白Ⅰ抗孵育切片。

3.5 尼氏染色甲苯胺藍法 切片入0.1%甲苯胺藍溶液2 min，保持40℃，蒸餾水沖洗后梯度乙醇分化，自然風干，二甲苯透明，中性樹膠封片。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，實驗一部分兩組間比較采用兩組獨立樣本的t檢驗，實驗二部分多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差(Oneway ANOVA)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 TGF－β1具有明顯的抗癲癇作用

正常對照(control)組大鼠無癲癇發(fā)作，Pilo組大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后第9 d出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作，TGF－β1治療組大鼠第12 d出現(xiàn)，TGF－β1治療組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、等級分數(shù)及持續(xù)時間均較Pilo組有明顯減少，見表1。

表1 自發(fā)性癲癇發(fā)作的平均頻率、程度及持續(xù)時間Table 1.Average frequency，severity and duration of spontaneous seizures(±s.n=5)

表1 自發(fā)性癲癇發(fā)作的平均頻率、程度及持續(xù)時間Table 1.Average frequency，severity and duration of spontaneous seizures(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs Pilo group.

Group Frequency(d－1) Seizure score Seizure duration(s)Pilo 6.37 ±0.44 3.21 ±0.14 53.20 ±10.03 TGF－β1+Pilo 2.32 ±0.66＊＊ 1.90 ±0.21* 37.57 ±9.20*

2 TGF－β1抑制癲癇持續(xù)狀態(tài)后星形膠質細胞的激活

在正常組大鼠海馬區(qū)星形膠質細胞有基礎表達，數(shù)量較少，形態(tài)學表現(xiàn)為胞體較薄，周圍突起較少，為未活化的星形膠質細胞。癲癇持續(xù)狀態(tài)后GFAP陽性細胞數(shù)量增加，1 d與正常對照組相比未見明顯差異，7 d左右數(shù)量達到高峰，14 d后逐漸減少，28 d時仍處相對較高水平。TGF－β1治療組GFAP陽性細胞數(shù)量較Pilo組顯著降低，14 d左右降至正常水平。激活的星形膠質細胞形態(tài)學表現(xiàn)為胞體肥大，突起增大增粗，并可能出現(xiàn)極化等，見表2、圖1。

表2 不同時點海馬CA3區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)Table 2.The number of GFAP(+)cells in hippocampal CA3 region at different time points(±s.n=5)

表2 不同時點海馬CA3區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)Table 2.The number of GFAP(+)cells in hippocampal CA3 region at different time points(±s.n=5)

*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs Pilo group.

Group 1 d 7 d 14 d 28 d Control 25.35 ±10.38 27.62 ±9.89 24.57 ±13.4526.94 ±5.72 Pilo 37.38 ±7.64 117.52 ±23.01* 84.48 ±18.24* 49.67 ±9.79*TGF－β1+pilo 33.82 ±12.61 103.89 ±19.45* 49.20 ±15.91#32.77 ±13.19

Figure 1.The expression of GFAP 14 d after status epilepticus.Bar:100 μm.A:control;B:Pilo;C:TGF－β1+Pilo.圖1 癲癇持續(xù)狀態(tài)14 d后海馬CA3區(qū)GFAP的表達

3 TGF－β1抑制小膠質細胞的活化數(shù)目

與星形膠質細胞相似，正常組Iba1(+)數(shù)量較少，形態(tài)學表現(xiàn)為胞體較薄，周圍有大量樹枝狀突起，為未活化小膠質細胞。在Pilo組Iba1(+)數(shù)量迅速增加，7 d達到高峰，14 d后逐漸下降，28 d降至正常水平。TGF－β1治療組Iba1陽性細胞數(shù)變化趨勢與GFAP相似，14 d左右較Pilo組有顯著降低，基本降至正常水平。活化的小膠質細胞表現(xiàn)為胞體肥大變圓，周圍突起減少，變短增粗，見表3、圖2。

表3 不同時點海馬CA3區(qū)Iba1陽性細胞數(shù)Table 3.The number of Iba1(+)cells in hippocampal CA3 region at different time points(±s.n=5)

表3 不同時點海馬CA3區(qū)Iba1陽性細胞數(shù)Table 3.The number of Iba1(+)cells in hippocampal CA3 region at different time points(±s.n=5)

*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs Pilo group.

Group 1 d 7 d 14 d 28 d Control 19.38 ±6.52 21.22 ±8.02 20.29 ±4.71 17.61 ±7.44 Pilo 48.45 ±8.38* 112.65 ±11.81* 104.11 ±9.36* 25.98 ±5.17 TGF－β1+pilo 43.36 ±7.57* 97.17 ±9.45* 32.28 ±8.31#21.49 ±6.72

Figure 2.The expression of Iba1 14 d after status epilepticus.Bar:100 μm.A:control;B:Pilo;C:TGF－β1+Pilo.圖2 癲癇持續(xù)狀態(tài)14 d后海馬CA3區(qū)Iba1的表達

4 TGF－β1減少神經元死亡

正常組大鼠CA3區(qū)見大量致密的椎體細胞，排列整齊，形態(tài)完整，胞漿內尼氏小體豐富;癲癇持續(xù)狀態(tài)14 d后Pilo組細胞形態(tài)不完整，細胞腫脹，破裂，輪廓模糊，排列紊亂，細胞間距加大，胞漿內尼氏小體減少;TGF－β1治療組存活神經元較Pilo組明顯增多，見圖3。正常組CA3區(qū)神經元數(shù)目為104.56 ±12.33;，Pilo組為39.47 ±10.89;TGF－β1治療組為87.62±8.57;TGF－β1治療組與 Pilo組相比差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

Figure 3.Nissl－stained sections of hippocampal CA3 region 14 d after status epilepticus.Bar:100 μm.A:control;B:Pilo;C:TGF－β1+Pilo.圖3 癲癇持續(xù)狀態(tài)14 d后海馬CA3區(qū)Nissl染色結果

討 論

TGF－β1是多功能的轉化生長因子，其生物作用依據(jù)細胞類型和環(huán)境而發(fā)生變化。它在免疫調節(jié)、細胞生長分化、細胞外基質的合成及貯存、胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復、骨骼重建和中樞神經系統(tǒng)發(fā)育等方面發(fā)揮著十分重要的作用。目前大量實驗表明TGF－β1可以通過多種途徑促進缺血缺氧性腦損傷所引起的神經細胞的康復，并在阿爾茨海默病、帕金森病、AIDS腦病等多種神經系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經保護作用［9－10］。但是外源性TGF－β1相對分子質量較大，不易通過血腦屏障到達中樞。經鼻給藥作為一種無創(chuàng)的，非侵入性的，相對比較方便的途徑可使藥物分子通過嗅部黏膜沿包繞在嗅神經束周圍的連接組織或嗅神經元軸突到達腦脊液或腦部，因而可繞過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)，發(fā)揮治療作用。實驗表明經鼻TGF－β1可以在迅速進入嗅球、紋狀體、丘腦和大腦皮層等腦區(qū)［11］。

星形膠質細胞對腦細胞外環(huán)境的控制中起關鍵作用，具有限制胞外鉀離子和興奮性氨基酸谷氨酸鹽堆積的作用?；罨男切文z質細胞在其分子、細胞結構、形態(tài)學及功能學方面會發(fā)生改變，包括:(1)降低了鉀離子通道(Kir4.1)和水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)的表達，損害了膠質細胞對腦組織內鉀離子的緩沖能力，促使神經元興奮閾值降低，增加同步化放電和突觸的可塑性，最終使神經元去極化，同時可激活N－甲基－D－天冬氨酸(NMDA)受體等;(2)使谷氨酸鹽的代謝受阻，膠質細胞可表達谷氨酸鹽受體，并能促進谷氨酸鹽的吸收和代謝，活化的膠質細胞對谷氨酸鹽清除能力降低，造成谷氨酸鹽蓄積可使細胞的興奮性增加。導致神經元同步去極化放電及自發(fā)性癲癇發(fā)作;(3)降低縫隙連接，星形膠質細胞通過彼此縫隙連接共同形成大的細胞網(wǎng)絡以促進對腦內小分子蛋白的緩沖能力［12－14］，活化的膠質細胞對蛋白的緩沖能力降低。同時激活的星形膠質細胞可增加血腦屏障的滲透性，促使血液中鉀離子滲透入腦組織，鉀離子的蓄積本身可以作為癲癇發(fā)作的一個誘因［13］，所以星形膠質細胞的激活可增加神經元的興奮性，癲癇的易感性。因此抑制星形膠質細胞的活化數(shù)量，可使神經元的興奮性降低并可在一定程度上改善血腦屏障的通透性。

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中固有的免疫源性細胞和免疫監(jiān)視細胞并在免疫炎癥反應中起著重要作用，在中樞神經系統(tǒng)感染、腫瘤、外傷、中毒等情況下小膠質細胞可快速激活，表現(xiàn)為阿米巴樣，吞噬死亡的細胞，并釋放生長因子促進組織恢復。但過量活化的小膠質細胞可分泌和釋放如基質金屬蛋白酶(MMPs)、氧自由基、NO、IL－1β、TNF－α等炎癥因子和神經毒性因子，并激活經典和旁路補體途徑，可導致腦氧化應激，神經毒性，神經元損傷、破壞和死亡，同時激活的小膠質細胞可促進星形膠質細胞的活化［15］。目前大量實驗表明炎性因子可直接誘導癲癇的發(fā)作［16］，因此活化的小膠質細胞可直接損害腦神經細胞并可間接促進神經元的興奮性。本實驗觀察到經鼻滴入TGF－β1可抑制小膠質細胞的過量活化，14 d達到高峰，同時癲癇持續(xù)狀態(tài)后14 d時尼氏染色顯示存活神經元較Pilo組明顯增加，因此我們認為與TGF－β1抑制小膠質細胞的過度活化而發(fā)揮神經保護作用有關。同樣在缺血缺氧性腦損傷的基礎實驗中亦觀察到TGF－β1可顯著抑制小膠質細胞的活化［17］。因此TGF－β1通過抑制小膠質細胞的活化可以改善腦組織炎癥因子和神經毒性因子的表達發(fā)揮神經保護作用。

綜上所述，本實驗觀察到經鼻滴入TGF－β1有效降低了自發(fā)性癲癇發(fā)作，抑制膠質細胞活化和阻止了癲癇所引起的神經元死亡，同時我們認為TGF－β1抑制慢性期自發(fā)性癲癇的發(fā)作和發(fā)揮神經保護作用是通過抑制膠質細胞活化實現(xiàn)的。

［1］ Simonato M，Zucchini S.Are the neurotrophic factors a suitable therapeutic target for the prevention of epileptogenesis?［J］.Epilepsia，2010，51(Suppl 3):48－51.

［2］ Curia G，Longo D，Biagini G，et al.The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy［J］.J Neurosci Methods，2008，172(2):143－157.

［3］ Zhu Y，Yang GY，Ahlemeyer B，et al.Transforming growth factor－β1increases bad phosphorylation and protects neurons against damage［J］.J Neurosci，2002，22(10):3898－3909.

［4］ Ruocco A，Nicole O，Docagne F，et al.A transforming growth factor－β antagonist unmasks the neuroprotective role of this endogenous cytokine in excitotoxic and ischemic brain injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(12):1345－1353.

［5］ Henrich－Noack P，Prehn JH，Krieglstein J.TGF－β1protects hippocampal neurons against degeneration caused by transient global ischemia.Dose－response relationship and potential neuroprotective mechanisms［J］.Stroke，1996，27(9):1609－1614;discussion 1615.

［6］ Wetherington J，Serrano G，Dingledine R.Astrocytes in the epileptic brain［J］.Neuron，2008，58(2):168－178.

［7］ Marin－Teva JL，Cuadros MA，Martin－Oliva D，et al.Microglia and neuronal cell death［J］.Neuron Glia Biol，2011，7(1):25－40.

［8］ Stienen MN，Haghikia A，Dambach H，et al.Anti－inflammatory effects of the anticonvulsant drug levetiracetam on electrophysiological properties of astroglia are mediated via TGFβ1 regulation［J］.Br J Pharmacol，2011，162(2):491－507.

［9］ Ma M，Ma Y，Yi X，et al.Intranasal delivery of transforming growth factor－β1 in mice after stroke reduces infarct volume and increases neurogenesis in the subventricular zone［J］.BMC Neurosci，2008，9:117.

［10］ Caraci F，Spampinato S，Sortino MA，et al.Dysfunction of TGF－β1 signaling in Alzheimer's disease:perspectives for neuroprotection［J］.Cell Tissue Res，2012，347(1):291－301.

［11］ Ma YP，Ma MM，Ge S，et al.Intranasally delivered TGF－β1 enters brain and regulates gene expressions of its receptors in rats［J］.Brain Res Bull，2007，74(4):271－277.

［12］ Oliet SH，Piet R，Poulain DA.Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons［J］.Science，2001，292(5518):923－926.

［13］ Friedman A，Kaufer D，Heinemann U.Blood－brain barrier breakdown－inducing astrocytic transformation:novel targets for the prevention of epilepsy［J］.Epilepsy Res，2009，85(2－3):142－149.

［14］ Wallraff A，Kohling R，Heinemann U，et al.The impact of astrocytic gap junctional coupling on potassium buffering in the hippocampus［J］.J Neurosci，2006，26(20):5438－5447.

［15］ Najjar S，Pearlman D，Miller DC，et al.Refractory epilepsy associated with microglial activation［J］.Neurologist，2011，17(5):249－254.

［16］ Li G，Bauer S，Nowak M，et al.Cytokines and epilepsy［J］.Seizure，2011，20(3):249－256.

［17］ McNeill H，Williams C，Guan J，et al.Neuronal rescue with transforming growth factor－β1 after hypoxic－ischaemic brain injury［J］.Neuroreport，1994，5(8):901－904.