腺苷A2a受體在紅景天苷調(diào)節(jié)大鼠低氧性肺動脈高壓中的作用*

黃曉穎， 樊 榮， 蔡學(xué)定， 張 協(xié)， 盧園園， 王良興

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江溫州325003;2揚(yáng)州市江都人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇揚(yáng)州225200)

腺苷是體內(nèi)重要的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)，是強(qiáng)大的血管舒張劑，是公認(rèn)的強(qiáng)效肺動脈舒張劑［1］。腺苷的諸多作用通過其受體所介導(dǎo)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4種腺苷受體(adenosine receptor，AR)亞型，分別是A1AR、A2aAR、A2bAR和 A3AR。A2aAR由于其廣泛的生理病理調(diào)節(jié)作用而受到人們的關(guān)注，在體循環(huán)其被腺苷及腺苷類似物活化后，具有舒張血管平滑肌、擴(kuò)張冠狀動脈和外周動脈的作用［2］;以及抗炎和免疫抑制作用［3］。本實(shí)驗(yàn)擬觀察A2aAR是否能抑制低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓。紅景天苷(salidroside)是景天科植物紅景天的最主要藥理成分，具有抗疲勞、抗缺氧、抗氧化、抗纖維化、清除氧自由基等作用［4］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制低氧性肺動脈高壓的作用，本實(shí)驗(yàn)擬研究紅景天苷對A2aAR表達(dá)的影響，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 動物模型的復(fù)制和分組

雄性SPF級 Sprague－Dawley(SD)大鼠60只(由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體重(200±20)g，隨機(jī)均勻分為6組，每組10只。A:正常對照組;B:低氧組;C:低氧+紅景天苷低劑量組;D:低氧+紅景天苷中劑量組;E:低氧+紅景天苷高劑量組;F:低氧+A2aAR激動劑(CGS－21680)組。B～E組大鼠均置于常壓低氧艙，氧濃度控制在8% ～11%，CO2濃度維持在1% ～3%，每天8 h(8:00～16:00)，每周6 d，共4周。B組每次入艙前0.5 h腹腔注射4 mL/kg生理鹽水。C～E組每次入艙前0.5 h腹腔注射紅景天苷(購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號為201112，純度98%，干粉)，低、中、高劑量分別為2 mg/kg、8 mg/kg和32 mg/kg。F 組 CGS－21680(分子式:C23H29N7O6，分子量:535.99，每瓶 10 mg，批號為1063/10，Tocris產(chǎn)品，純度≥98%)的劑量為0.2 mg/kg。

2 平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)、平均頸動脈壓(mean carotid arterial pressure，mCAP)和右心指數(shù)［right ventricle/(left ventricle+septum)，RV/(LV+S)］的測定

造模4周后，5%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，行頸正中切口，分離右頸外靜脈和左頸總動脈，右心導(dǎo)管法測量大鼠肺動脈壓力。將自制彎頭的聚乙烯導(dǎo)管(外徑1.1 mm，內(nèi)徑0.8 mm)從右頸外靜脈進(jìn)入右心室、肺動脈，通過YL－4型壓力傳感器和MedLab生物數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)記錄右心室壓力波和肺動脈壓力波，測定mPAP。左頸總動脈插管，YL－3型壓力傳感器和MedLab生物數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)記錄頸動脈壓力波，測定mCAP。

放血處死動物后，分離心臟，PBS緩沖液洗去血液，棄除心房，沿室間隔把心臟剪開成右心室壁(right ventricle，RV)和左心室加室間隔(left ventricle+septum，LV+S)兩部分，濾紙吸干液體后分別用電子天平稱重，計(jì)算兩者的比值RV/(LV+S)來反映右心室重量的變化。

3 光鏡制作標(biāo)本及觀察

放血處死大鼠，取出大鼠肺組織，迅速置入4%多聚甲醛液中固定，固定24～48 h后取出肺組織，肺門水平橫切，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約4 μm，脫蠟至水，HE染色，顯微鏡下觀察，測量肺小動脈管壁面積(vessel wall area，WA)和管總面積(vessel total area，TA)，并計(jì)算其比值WA/TA。

4 免疫組化法檢測各組大鼠肺小動脈管壁A2aAR相對含量

兔抗大鼠多克隆抗體(I抗)購自Thermo，1∶100稀釋，兔二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。肺組織石蠟切片，3%過氧化氫室溫處理，加牛血清封閉，滴加I抗、Ⅱ抗，DAB顯色，陽性結(jié)果呈棕黃色。每只大鼠選1張肺組織切片，每張切片隨機(jī)選取直徑50～200 μm的肺細(xì)小動脈5支，Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測A2aAR的平均吸光度，隨機(jī)測定5個(gè)高倍視野后計(jì)算其平均值，作為該片的A2aAR值。

5 原位雜交法檢測各組大鼠肺細(xì)小動脈管壁A2a AR mRNA相對含量

5.1 寡核苷酸探針 地高辛標(biāo)記的多聚核苷酸探針購自武漢博士德生物工程有限公司。探針序列，A2aAR:(1)5’－AACAG TAACC TGCAC AACGT CACCA ACTTC TTTGT－3’;(2)5’－TGGAA CAACT GCAGT CAGAA AGACG GGAAC TCCAC－3’;(3)5’－AACTG TTTCA CCTTC TTCTG CTCCA CGTGC CGGCA－3’。

5.2 雜交過程 肺組織石蠟切片，脫蠟至水，3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化，地高辛標(biāo)記的A2aAR寡核苷酸探針雜交，封閉，滴加兔抗地高辛，生物素化羊抗兔IgG，DAB顯色，陽性結(jié)果呈棕黃色。每只大鼠取1張肺組織切片，隨機(jī)選取5支直徑約50～200 μm肺細(xì)小動脈為分析對象，用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測A2aAR的平均吸光度值，隨機(jī)測定5個(gè)高倍視野后計(jì)算其平均值，作為該片的A2aAR mRNA值。

6 大鼠肺組織勻漿A2aAR mRNA表達(dá)的檢測

取大鼠右肺組織80～100 mg提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行普通PCR先確認(rèn)標(biāo)本具有陽性表達(dá)后，再用real－time RT－PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，使用SYBR Green real－time RT－PCR相對定量的方法。比較各組管家基因GAPDH以及目的基因的Ct值，運(yùn)用2－ΔΔCt方法，得出mRNA的相對表達(dá)量。最終結(jié)果由PCR儀配套軟件自動計(jì)算，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

7 各組大鼠肺組織勻漿A2aAR蛋白的測定(Western blotting)

取大鼠右肺組織80～100 mg，加入400 μL組織裂解液在冰上研磨，冰浴，超聲裂解，離心，取上清(即蛋白提取液)。用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。常規(guī)SDS－PAGE電泳(每孔上樣80 μg蛋白)，三明治法恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(300 mA，40 min)，封閉液室溫封閉。棄去封閉液，滴加A2aARⅠ抗(兔抗大鼠多克隆抗體，稀釋濃度1∶1 000)4℃過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔Ⅱ抗(碧云天，1∶500)室溫孵育2 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光顯影。將顯影后的膠片掃描至電腦中，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析A2aAR吸光度。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組樣本均數(shù)比較用方差檢驗(yàn)，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠mPAP、mCAP和RV/(LV+S)的比較

低氧組mPAP顯著高于正常組(P＜0.01)，紅景天苷中、低劑量組mPAP雖然較低氧組有減低趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，紅景天苷高劑量組mPAP顯著低于低氧組(P＜0.01)。CGS－21680組mPAP顯著低于低氧組(P＜0.01)，見表2。

各組mCAP無顯著差異，見表2。

低氧組RV/(LV+S)顯著高于正常組(P＜0.01)，紅景天苷低劑量組雖然較低氧組有減低趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，紅景天苷中劑量組低于低氧組(P＜0.05)，紅景天苷高劑量組顯著低于低氧組(P＜0.01)，CGS－21680組顯著低于低氧組(P ＜0.01)，見表 2。

2 A2aAR和紅景天苷對慢性低氧大鼠肺細(xì)小動脈顯微結(jié)構(gòu)的影響

光鏡下，慢性低氧組大鼠肺細(xì)小動脈管腔明顯狹窄，中膜平滑肌細(xì)胞顯著增生，炎癥細(xì)胞浸潤;CGS－21680組和紅景天苷組肺細(xì)小動脈管腔狹窄程度、中膜平滑肌細(xì)胞增生程度、炎癥細(xì)胞浸潤程度與低氧組相比明顯減輕。WA/TA較對照組顯著增高(P＜0.01)，CGS－21680組和紅景天苷組均明顯低于低氧組(P ＜0.01)，見表2。

3 各組大鼠肺細(xì)小動脈管壁A2aAR mRNA及蛋白含量的比較

低氧組肺細(xì)小動脈管壁A2aAR mRNA及蛋白表達(dá)高于正常組(P＜0.01)，A2aAR激動劑組和紅景天苷高劑量組A2aAR mRNA及蛋白表達(dá)較低氧組進(jìn)一步升高(P ＜0.01)，見圖1、2 和表3。

表2 各組大鼠mPAP、mCAP、RV/(LV+S)和WA/TA的比較Table 2.Changes of mPAP，mCAP，RV/(LV+S)and WA/TA in different groups(±s.n=8)

表2 各組大鼠mPAP、mCAP、RV/(LV+S)和WA/TA的比較Table 2.Changes of mPAP，mCAP，RV/(LV+S)and WA/TA in different groups(±s.n=8)

▲▲P ＜0.01 vs normal control group，★P ＜0.05，★★P ＜0.01 vs hypoxia group.

Group mPAP(mmHg) mCAP(mmHg) RV/(LV+S)(%) WA/TA(%)Normal control 12.63 ±6.57 96.1 ±7.4 29.63 ±2.70 47.68 ±3.58 Hypoxia 20.88 ±3.87▲▲ 90.0 ±8.9 35.22 ±2.02▲▲ 72.62 ±5.09▲▲Hypoxia+salidroside(low dose) 17.40 ±7.35 86.7 ±12.5 35.95 ±4.53 63.93 ±8.70★Hypoxia+salidroside(median dose) 17.97 ±3.89 85.2 ±16.9 31.84 ±4.09★ 55.37 ±7.62★★Hypoxia+salidroside(high dose) 15.64 ±3.31★★ 86.3 ±12.5 29.04 ±2.86★★ 60.12 ±10.66★★Hypoxia+CGS－21680 14.75 ±3.77★★ 85.8 ±5.4 28.27 ±8.81★★ 54.17 ±3.44★★

Figure 1.Expression of A2aAR mRNA in pulmonary arterioles in different groups(in situ hybridization，×200).A:normal control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+salidroside(low dose)group;D:hypoxia+salidroside(median dose)group;E:hypoxia+salidroside(high dose)group;F:hypoxia+CGS－21680 group.圖1 各組肺細(xì)小動脈A2aAR mRNA的檢測

Figure 2.Expression of A2aAR protein in pulmonary arterioles in different groups(immunohistochemistry，×200).A:normal control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+salidroside(low dose)group;D:hypoxia+salidroside(median dose)group;E:hypoxia+salidroside(high dose)group;F:hypoxia+CGS－21680 group.圖2 各組肺細(xì)小動脈A2aAR蛋白的檢測

表3 各組大鼠肺細(xì)小動脈管壁A2aAR mRNA及蛋白表達(dá)的比較Table 3.Expression of A2aAR mRNA and protein in pulmonary arterioles in rats of different groups(±s.n=8)

表3 各組大鼠肺細(xì)小動脈管壁A2aAR mRNA及蛋白表達(dá)的比較Table 3.Expression of A2aAR mRNA and protein in pulmonary arterioles in rats of different groups(±s.n=8)

▲▲P ＜0.01 vs normal control group;★★P ＜0.01 vs hypoxia group.

Group A2aAR mRNA A2a AR protein Normal control 0.113±0.010 0.045±0.008 Hypoxia 0.171±0.017▲▲ 0.135±0.080▲▲Hypoxia+salidroside(low dose) 0.168±0.014 0.138±0.005 Hypoxia+salidroside(median dose) 0.179±0.018 0.139±0.006 Hypoxia+salidroside(high dose) 0.200±0.031★★ 0.193±0.014★★Hypoxia+CGS－21680 0.206±0.019★★ 0.202±0.014★★

4 各組大鼠肺組織勻漿A2aAR mRNA和蛋白表達(dá)的比較

低氧組肺組織A2aAR mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于正常組(P＜0.01)，紅景天苷高劑量組和A2aAR激動劑組肺組織A2aAR mRNA和蛋白進(jìn)一步高于低氧組(P ＜0.01)，見圖3、表4。

Figure 3.A2aAR protein expression in lung homogenate in different groups.±s.n=4.A:normal control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+salidroside(low dose)group;D:hypoxia+salidroside(median dose)group;E:hypoxia+salidroside(high dose)group;F:hypoxia+CGS－21680 group.▲▲P ＜0.01 vs normal control group;★★P ＜0.01 vs hypoxia group.圖3 各組肺組織勻漿A2aAR蛋白的表達(dá)

討 論

慢性低氧性肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，尚未完全明了，目前認(rèn)為低氧性肺血管收縮，低氧性肺血管重建是其形成的主要原因［5］。低氧時(shí)，肺部血管舒張因子(如一氧化氮、前列環(huán)素2等)和收縮因子(如內(nèi)皮素、血栓素A2、前列腺素H2等)失衡;通過一系列信號傳遞引起血管平滑細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，引起血管平滑肌收縮。導(dǎo)致低氧性肺血管收縮［6］。肺血管重建是缺氧肺動脈高壓的主要變化特征。近年來報(bào)道 JAK/STAT、PKC－MAPK、PI3K/PKB等多途徑參與了低氧情況下肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移［7－8］。此病理過程中，肺動脈平滑肌細(xì)胞大量增殖，從中膜遷移于內(nèi)膜，主要表現(xiàn)為＜60 μm的無肌層肺小動脈出現(xiàn)明顯的肌層，＞60 μm的肺小動脈(如肌型動脈和前毛細(xì)血管動脈)中層增厚，內(nèi)膜及外膜膠原及基質(zhì)增生，使血管變硬，阻力增加［9］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷對低氧肺動脈高壓大鼠具有一定保護(hù)作用，可抑制低氧誘導(dǎo)的肺血管膠原增生。A2aAR在體循活化后，具有舒張血管平滑肌以及抗炎和免疫抑制作用。本文重點(diǎn)研究了A2aAR在紅景天苷調(diào)節(jié)大鼠低氧肺動脈高壓中的作用。

表4 各組大鼠肺組織勻漿A2aAR mRNA和蛋白表達(dá)的比較Table 4.Expression of A2aAR mRNA and protein in lung homogenate in rats of different groups(±s.n=8)

表4 各組大鼠肺組織勻漿A2aAR mRNA和蛋白表達(dá)的比較Table 4.Expression of A2aAR mRNA and protein in lung homogenate in rats of different groups(±s.n=8)

▲P ＜ 0.05，▲▲ P ＜ 0.01 vs normal control group;★ P ＜0.05，★★P ＜0.01 vs hypoxia group.

Group A2aAR mRNA A2a AR protein Normal control 1.0000±0.0000 0.041±0.008 Hypoxia 1.5917±0.4776▲ 0.127±0.011▲▲Hypoxia+salidroside(low dose) 1.5226±0.6095 0.128±0.007 Hypoxia+salidroside(median dose) 1.7501±0.6756 0.131±0.011 Hypoxia+salidroside(high dose) 2.1900±0.5835★ 0.171±0.021★★Hypoxia+CGS－21680 2.2933±0.7508★ 0.173±0.008★★

1 低氧肺動脈高壓模型的復(fù)制

本研究結(jié)果顯示，常壓低氧大鼠平均肺動脈壓明顯高于正常對照組，表明4周的低氧環(huán)境已經(jīng)使大鼠形成了肺動脈高壓。光鏡下，慢性低氧組大鼠炎癥細(xì)胞浸潤，肺細(xì)小動脈管壁增厚，WA/TA較正常對照組顯著增加，表明肺血管重構(gòu)已經(jīng)形成。此外，慢性低氧組和正常對照組相比右心指數(shù)明顯升高。這些數(shù)據(jù)表明慢性低氧性肺動脈高壓、肺血管重構(gòu)及右心室肥厚模型已經(jīng)建立成功。

2 A2aAR對低氧肺動脈高壓大鼠的保護(hù)作用

A2aAR在體內(nèi)起著重要的擴(kuò)血管、抗炎和修復(fù)的作用［10］。Thiel等［11］發(fā)現(xiàn)，低氧誘發(fā) A2aAR 表達(dá)增多，抑制了急性呼吸窘迫綜合癥的發(fā)展。另外在心肌組織，低氧使A2aAR表達(dá)增加，抑制了一些炎癥介質(zhì)，如 IL－6、TNF－α 等的釋放［12］。同樣，在肝組織中，低氧上調(diào)A2aAR的表達(dá)，并抑制低氧誘發(fā)的肝細(xì)胞損傷［13］。這說明在低氧刺激下，A2aAR表達(dá)量增加，可能是機(jī)體減輕低氧誘發(fā)的應(yīng)激損傷的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化、原位雜交、real－time RT－PCR和Western blotting等方法定位和定量檢測大鼠肺血管和肺組織勻漿均發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，A2aAR表達(dá)明顯增多，這與以上研究均相符。Alchera等［14］認(rèn)為低氧能夠上調(diào)A2aAR，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。我們推測，腺苷受體可能對低氧性肺動脈高壓的發(fā)展起持續(xù)的調(diào)節(jié)作用，故采用選擇性A2aAR激動劑CGS－21680。與低氧組相比，CGS－21680組大鼠A2aAR表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)的同時(shí)，肺動脈壓明顯下降，肺組織炎癥細(xì)胞浸潤減少，肺細(xì)小動脈管重構(gòu)減輕，這說明A2aAR具有減輕低氧性肺動脈高壓和肺血管重建的作用。

3 紅景天苷對低氧肺動脈高壓的保護(hù)作用及機(jī)制研究。

紅景天苷是景天科植物大花紅景天的干燥根及根莖，有高原參之美譽(yù)。它主要生長在高寒地帶，具有抑制高原低氧肺動脈高壓的作用［15］。研究大鼠外周骨骼肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能夠增加一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)含量，并且隨著劑量的增加有上升趨勢［16］。在缺氧和炎癥反應(yīng)過程中，大量胞內(nèi)和胞外的腺苷通過ATP分解產(chǎn)生［17］。因此我們推測紅景天苷可能通過增加ATP來激活腺苷。

本實(shí)驗(yàn)通過常壓低氧肺動脈高壓模型，發(fā)現(xiàn)低、中劑量紅景天苷有降低mPAP趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高劑量紅景天苷能夠顯著降低mPAP。光鏡下我們發(fā)現(xiàn)紅景天苷各濃度組均能不同程度抑制慢性低氧引起的肺細(xì)小動脈管壁增厚，降低WA/TA，減少炎癥細(xì)胞浸潤，并且呈劑量依賴性。提示紅景天苷具有減輕低氧誘發(fā)的肺動脈高壓和肺血管重建的作用。

本研究通過免疫組化、原位雜交、real－time RT－PCR和Western blotting等方法發(fā)現(xiàn)低氧條件下，高劑量紅景天苷可使肺細(xì)小動脈和肺組織A2aAR mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)進(jìn)一步升高。如前所訴，A2aAR具有擴(kuò)血管、抗炎的作用。因此推測，紅景天苷可能通過增加A2aAR表達(dá)，提高機(jī)體代償極限，從而減輕低氧所誘導(dǎo)的肺動脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)，對機(jī)體起保護(hù)作用。

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