Exendin－4通過抗氧化應激減輕糖尿病心肌病心肌纖維化的實驗研究

丁貴娥，楊 靜

糖尿病心肌病（DCM）是一種特異性心肌病，病理表現(xiàn)為心肌肥厚和心肌纖維化，其發(fā)病機制尚未完全明了，研究表明高血糖導致活性氧代謝產(chǎn)物（ROS）的增多、氧化應激增強激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），進而引起心肌纖維化在其發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用［1，2］。Hisko等［3］指出，胰高血糖素樣肽－1（GLP－1）能夠通過激酶A（PKA）的激活減少活性氧的產(chǎn)生。Exendin－4是一種從蜥蜴毒液中分離出的含39個氨基酸的多肽。研究表明，在哺乳動物體內(nèi)Exendin－4與GLP－1有相同的生理功能。本研究觀察Exendin－4能否改善糖尿病心肌纖維化，以及這種效應是否通過抗氧化應激實現(xiàn)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 38只清潔 Wistar雄性大鼠，6周齡，體質(zhì)量180g～220g，自由進食、水。

1.2 大鼠DCM模型的建立 隨機選取8只作為正常對照組（NC組）給予常規(guī)飼料，其余30只給予高糖高脂飼料（10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇、1%膽鹽、67%常規(guī)飼料），4周后腹腔注射40mg／kg鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司，溶于0.1mol／L，pH4.2的枸櫞酸緩沖液中）。對照組僅腹腔內(nèi)注射等量的枸櫞酸緩沖液。2周后血糖≥16.7mmol／L的大鼠為糖尿病模型。26只大鼠符合2型糖尿病標準，隨機分為Exendin－4低劑量組（8只）、Exendin－4高劑量組（8只）、DCM組（10只）、Exendin－4低劑量組、Exendin－4高劑量組分別給予Exendin－4 4μg／kg、20 μg／kg每日皮下注射，治療6周。DCM組僅給予高脂高糖飼料。

1.3 血標本的獲取及觀察指標 實驗結(jié)束時以20%烏拉坦溶液4mL／kg腹腔注射麻醉，剖殺大鼠，心房內(nèi)取血，離心分離血清，檢測膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）及高密度脂蛋白（HDL）。

1.4 組織標本的制備及觀察指標 迅速取出心臟，在冰鹽水中沖洗干凈，濾紙吸去多余水分。在左心室中部留取小塊組織，放入100g／L中性甲醛液內(nèi)，24h后石蠟包埋。免疫組織化學分析采用SP染色試劑盒，所用抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，30g／L過氧化氫孵育10min消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，高壓熱修復抗原，按試劑盒所介紹的方法分別檢測基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）、血紅素加氧酶－1（HO－1）的表達情況，使用高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)的灰度定量法進行半定量分析。

1.5 HE、Masson染色 取少許左心室肌組織石蠟切片，行HE、Masson染色，光鏡下觀察心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍綠色，拍片，采用圖像分析儀定量心肌組織膠原的含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0行One－wayANOVA方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀況 糖尿病大鼠多食、多飲、體質(zhì)量明顯減輕，血糖水平升高，符合2型糖尿病的診斷標準；DCM組有2只大鼠死亡，可能死于感染或糖尿病并發(fā)癥。

2.2 血脂指標比較 低劑量組和高劑量組均導致三酰甘油和低密度脂蛋白的降低，二者降低水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 實驗末各組大鼠血脂指標比較（±s） mmol／L

表1 實驗末各組大鼠血脂指標比較（±s） mmol／L

組別TG TC HDL LDL NC組0.89±0.18 1.25±0.21 0.97±0.13 0.28±0.16 DCM組 2.33±0.21 2.53±0.11 0.76±0.14 0.83±0.17低劑量組 1.74±0.151） 2.44±0.08 0.82±0.11 0.63±0.091）高劑量組 1.26±0.181）2） 2.33±0.18 0.87±0.08 0.46±0.151）2）與DCM組比較，1）P＜0.05；與低劑量組比較，2）P＜0.05

2.3 大鼠心肌HO－1、MMP－9的表達水平 與NC組相比，DCM組HO－1的表達甚少，治療后表達明顯增加，大劑量組較顯著；DCM大鼠MMP－9的表達明顯升高，心肌組織膠原含量明顯升高，心肌間質(zhì)纖維化，Exendin－4治療后，MMP－9表達減少，心肌纖維化減輕，大劑量治療組較顯著。詳見表2。

2.4 心臟病理變化 HE染色NC組大鼠心臟結(jié)構(gòu)未見異常；DCM組心肌纖維排列紊亂、間隙增寬，細胞核大小不一、凋亡細胞核增多；Exendin－4治療后病理損傷明顯減輕，其中高劑量組減輕更明顯。Masson染色DCM組心臟膠原含量較NC組明顯增高（P＜0.05），Exendin－4治療后膠原含量明顯降低，其中高劑量組減輕更明顯（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組心肌MMP－9、HO－1水平及膠原含量比較（±s）

表2 各組心肌MMP－9、HO－1水平及膠原含量比較（±s）

組別 HO－1 MMP－9 膠原含量（%）NC組138.14±8.23 114.85±5.77 12±3 DCM組 121.68±9.59 175.75±2.29 20±2低劑量組 159.55±5.441） 162.45±3.901） 16±21）高劑量組 178.65±2.111）2） 133.65±5.301）2） 14±21）2）與DCM組比較，1）P＜0.05；與低劑量組比較，2）P＜0.05

3 討 論

糖尿病心肌病是糖尿病的重要并發(fā)癥之一。本研究以高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素注射建立的動物模型，在實驗早期就出現(xiàn)多飲、多食、多尿等糖尿病的臨床表現(xiàn)。12周時心肌病理結(jié)果顯示心肌細胞排列紊亂、大量膠原纖維分布，提示本研究成功建立了2型糖尿病心肌病動物模型。

氧化應激損傷在糖尿病心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注。血紅素加氧酶－1是體內(nèi)參與亞鐵血紅素代謝的一種具有多種功能的微粒體氧化酶，在氧化應激過程中起重要的細胞保護作用［4］。它能有效地清除ROS并抑制脂質(zhì)過氧化［4］，此外還可使細胞外超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的表達量增加來對抗氧化應激［5］。

本研究顯示，糖尿病組大鼠HO－1的表達明顯降低，提示糖尿病大鼠抗氧化能明顯降低；經(jīng)過Exendin－4的干預后，HO－1的表達較DCM組明顯升高，提示Exendin－4可以提高DCM大鼠抗氧化能力，這與Noyan－Ashraf等［6］的研究結(jié)果一致。高劑量組HO－1升高更加顯著，提示抗氧化能力的強弱與劑量相關(guān)。同時，糖尿病組大鼠心肌 MMP－9的表達明顯增加，間質(zhì)纖維化重，Exendin－4干預后心臟結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，間質(zhì)纖維化減輕，高劑量組減輕更加顯著，推測Exendin－4在改善DCM氧化應激損傷及心肌纖維化方面起著重要作用。

總之，氧化應激損傷在DCM的發(fā)生與發(fā)展中占有重要作用，Exendin－4通過提高糖尿病大鼠心肌抗氧化物質(zhì)HO－1的含量減弱氧化應激損傷，減輕心臟纖維化，對DCM有一定的防治作用。

［1］Solini A，Santini E，Nannipieri M，etal.High glucose and homocysteine synergistically affect the metalloproteinases tissue inhibitors of metalloproteinases pattern，but not TGFB expression，in human fibroblasts［J］.Diabetologia，2006，49：2499－2506.

［2］Solini A，Santini E，F(xiàn)errannini E.Effect of short－term folic acidsupplementation on insulin sensitivity and inflammatory markers in overweight subjects［J］.Int J Obes（Lond），2006，30：1197－1202.

［3］Hisko O，Rudolf A.de Boer，hendrik buikema glucagon－like peptide 1prevents reactive oxygen species－induced endothelial cell senescence through the activation of protein kinase A［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30：1407－1414.

［4］Yan Qu，Raymond FR，Charles W.Leffler helena parfenova，shyamali basuroy，sujoy bhattacharya，dilyara tcheranova glutamate induces oxidative stress and apoptosis in cerebral vascular endothelial cells：Contributions of HO－1and HO－2to cytoprotection［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006，290：C1399－C1410.

［5］Saadet T，Adam K，Christopher J，etal.Abraham Antioxidant mechanism of heme oxygenase－1involves an increase in superoxide dismutase and catalase in experimental diabetes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289：H701－H707.

［6］Noyan－Ashraf MH，Momen MA，Ban K，etal.GLP－1Ragonist liraglutide activates cytoprotective pathways and improves outcomes after experimental myocardial infarction in mice［J］.Diabetes，2009，58（4）：975－983.