環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

孫 濤，江 波，潘蓓蕾

（1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；3.中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會，北京 100006）

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

孫 濤1，江 波2，潘蓓蕾3，*

（1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；3.中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會，北京 100006）

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase，EC2.4.1.19）為食品工業(yè)中的重要酶，在生產(chǎn)中多用芽孢桿菌通過液體深層發(fā)酵獲得。CGTase主要用途為生產(chǎn)環(huán)糊精；環(huán)糊精在食品工業(yè)中有廣泛應(yīng)用。CGTase還可以通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)對食品添加劑和功能性成分如甜菊苷，蘆丁和抗壞血酸等進行酶法改性。此外，CGTase用于面包烘焙，可以改善成品面包的品質(zhì)，延遲面包老化等。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，環(huán)糊精，糖基化，烘焙，應(yīng)用

Abstract：Cyclodextrin glucanotransferases（CGTases，EC 2.4.1.19） are important enzymes of food industry，which are obtained through liquid fermentation.In food industry，CGTases widely applied in food industries that are mainly utilized to produce cyclodextrins from starch.In addition，CGTases can be used through transglycosylation to improve properties of food additives and functional components such as stevioside，rutin and L-ascorbic acid.Furthermore，it can also be applied in bread baking industry to improve the quality of bread and retard the staling process of bread.

Key words：Cyclodextrin glucanotransferase；cyclodextrin；transglycosylation；baking industry；application

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase，EC 2.4.1.19）是α-淀粉酶家族（家族13）的重要成員，是食品工業(yè)中的重要酶。CGTase是一種多功能酶，可催化四種酶反應(yīng)，分別為水解反應(yīng)（hydrolysis）、環(huán)化反應(yīng)（cyclization）、偶合反應(yīng)（coupling）和歧化反應(yīng)（disproportionation）[1]。CGTase在食品工業(yè)中的重要性主要表現(xiàn)在該酶能以淀粉作為底物，通過環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)環(huán)糊精（Cyclodextrin，簡稱CD）；根據(jù)葡萄糖單元的個數(shù)，環(huán)糊精主要包括α-、β-和γ-環(huán)糊精（分別含有6、7和8個葡萄糖單元）。環(huán)糊精在食品（包括香精香料）、醫(yī)藥、化妝品、分析化學(xué)和環(huán)境保護等諸多領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。根據(jù)催化生成環(huán)糊精的主要類型不同，CGTase可分為α、β和γ型CGTase，即α-、β-和γ-CGTase。除以淀粉為原料生產(chǎn)環(huán)糊精應(yīng)用于食品工業(yè)之外，CGTase還可以用來對食品添加劑和食品功能性成分，如甜菊苷、蘆丁和抗壞血酸等進行酶法改性，從而改善它們的物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)，比如水溶性、風(fēng)味和穩(wěn)定性等。另外，還有研究報道將CGTase應(yīng)用于面包烘焙以改善面包品質(zhì)和延遲面包老化。

1 CGTase的生產(chǎn)

1.1 生產(chǎn)菌株

自然界中產(chǎn)CGTase的微生物種類眾多，其中主要為芽孢桿菌（Bacillus），此外產(chǎn)CGTase微生物還包括Brevibacterium，Clostridium，Corynebacterium，Klebsiella， Micrococcus， Pseudomonas，Thermoanaerobacter和Thermoanaerobacterium等[2-3]。微生物來源不同，CGTase的性質(zhì)差異也很大；例如不同來源的CGTase，其分子量差別很大，從30ku到100ku不等。表1列舉了部分產(chǎn)CGTase的芽孢桿菌菌株及所產(chǎn)CGTase的主要性質(zhì)。

表1 不同來源CGTase及其主要性質(zhì)Table 1 CGTases of different sources and their main characterization

1.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

CGTase的微生物發(fā)酵生產(chǎn)中，不同菌株最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基也存在差異，但是存在共同的地方：一是淀粉幾乎是所有微生物生產(chǎn)CGTase的最佳碳源；二是最佳氮源一般是有機氮源，如蛋白胨。產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉對CGTase的產(chǎn)生有誘導(dǎo)作用，而單糖和雙糖的存在則會阻遏CGTase的合成。作為碳源，不同淀粉對CGTase產(chǎn)量亦有影響。已有的研究報道中，Bacillus firmus的最佳碳源為玉米淀粉[10]；Bacillus circulans DF 9R最佳碳源為大米和木薯淀粉[11]；而Bacillus G1[12]和B.stearothermophilus[13]最佳碳源則分別為木薯淀粉和可溶性淀粉。但是B.cereus和B.stearothermophilus[14]可利用簡單糖，如葡萄糖和果糖生產(chǎn)CGTase，而淀粉非其最佳碳源。

CGTase的生產(chǎn)中，有機氮源有利于CGTase的生產(chǎn)，無機氮源通常不適合CGTase的生產(chǎn)[15]。但也有極少數(shù)研究稱，無機氮源為產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳氮源，如Rosso等[11]研究報道用硫酸銨作為唯一氮源獲得了最大的CGTase產(chǎn)量。孫濤等[16]研究表明產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，可溶性淀粉為最佳碳源，大豆蛋白胨為最佳氮源；而用簡單糖和無機氮分別作碳源和氮源時，CGTase的產(chǎn)量極低。

1.3 基因工程酶的生產(chǎn)

一般情況下，自然選育的菌株發(fā)酵產(chǎn)CGTase的產(chǎn)量和生產(chǎn)強度均較低。為了克服野生菌株的低CGTase生產(chǎn)能力，構(gòu)建基因工程菌，使CGTase基因在基因工程菌中過量表達被認(rèn)為是最有效的途徑之一。在構(gòu)建基因工程菌時，采用的宿主菌主要是大腸桿菌（Escherichia coli）[17-22]，也有利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtlis）和畢赤酵母（Pichia pastoris）作為宿主菌的報道[17，22-23]。

基因工程菌一方面可以提高重組CGTase的產(chǎn)量[24-25]，另一方面，重組CGTase的酶學(xué)特性或催化活性得到改善和提高，如酶偶合活性的提高[17，24，26]；產(chǎn)物的特異性提高[21]；酶穩(wěn)定性的改善等[27]。不僅如此，來源于基因工程菌的重組CGTase的分離純化要比野生菌株容易得多。

CGTase生產(chǎn)、開發(fā)的潛力還很大，目前生產(chǎn)銷售CGTase的國內(nèi)企業(yè)很少，市場上CGTase酶制劑基本源于進口。因此，開發(fā)高產(chǎn)的CGTase菌株和具自主知識產(chǎn)權(quán)的CGTase、完善其生產(chǎn)和應(yīng)用工藝并拓展其應(yīng)用領(lǐng)域，可以推動食品工業(yè)和其他相關(guān)行業(yè)的發(fā)展。

CGTase生產(chǎn)、開發(fā)具有重要意義，其重要性表現(xiàn)在CGTase有較廣泛的用途。CGTase在食品工業(yè)中的用途主要包括利用淀粉原料生產(chǎn)環(huán)糊精、對食品添加劑和食品功能性成分進行改性以及在烘焙工業(yè)中的應(yīng)用等，將在下文中分別加以論述。

2 CGTase在環(huán)糊精生產(chǎn)中的應(yīng)用

CGTase最主要的用途為生產(chǎn)環(huán)糊精。環(huán)糊精是由CGTase作用于淀粉、糖原、寡聚糖等葡萄糖聚合物而形成的由6～12個葡萄糖單元以α-1，4-糖苷鍵連接而成的一組環(huán)狀低聚糖。常見的有α、β、γ-CD，它們分別是由6、7和8個葡萄糖基連結(jié)而成。這三種CD性質(zhì)存在差異，但結(jié)構(gòu)相似，擁有獨特的略呈錐形的圓桶形結(jié)構(gòu)，在外周有大量親水的羥基，內(nèi)部的空腔又有相對的疏水作用。CD是溶于水的，疏水的內(nèi)腔又能和大量的有機、無機分子相結(jié)合，同時還能改變結(jié)合分子的物理、化學(xué)性狀。

CD的最大特征就是通過分子包合的方式與各種固體、液體和氣體化合物形成固體包合物（主客體復(fù)合物）。在這些復(fù)合物中，客體分子進入CD主體分子的孔穴中。形成復(fù)合物必須主體孔穴與客體分子的尺寸匹配；CD分子的親脂性孔穴為那些大小合適的化合物形成復(fù)合物提供了微環(huán)境。

CD在食品中的應(yīng)用廣泛[28]，主要包括：保護食品中的對氧氣、光和熱敏感的親脂性成分；增加食品著色劑和維生素的溶解性；將液體食品轉(zhuǎn)化為固體粉末，以便于包裝、運輸、儲藏和使用；穩(wěn)定食品中的某些成分，如食品中的香精和色素；消除食品中的異味等；控制食品中組分的釋放。此外CD在食品中的應(yīng)用還包括食品中風(fēng)味物質(zhì)的提取和食品中活性成分及微量元素的分析與檢測等[29]。

利用CGTase生產(chǎn)的3種CD中，相比于α、γ-CD，β-CD在水中的溶解度低，易于分離和純化，生產(chǎn)方便，價格相對低廉，目前其應(yīng)用也最為廣泛[30]。表2列舉了不同來源的β-CGTase生產(chǎn)CD的比較[31]。

目前環(huán)糊精的生產(chǎn)主要是β-CD的生產(chǎn)，α-CD的生產(chǎn)較少，γ-CD的生產(chǎn)最少。但是由于γ-CD同α、β-CD相比分子結(jié)構(gòu)具有更大的空腔，可包合的客體分子范圍更廣，因而越來越引起研究者的關(guān)注和重視。

表2 不同微生物來源β-CGTase生成環(huán)糊精比較Table 2 Comparison of the CDs Productivity from different β-CGTases

3 CGTase在食品添加劑和功能性成分改性中的應(yīng)用

3.1 對抗壞血酸的改性作用

L-抗壞血酸（VC）參與體內(nèi)多種生理活動，在保持和促進人體健康中起到重要的作用。由于VC本身的理化特性和生理活性，可作為酸味劑、還原劑、抗氧化劑、漂白劑和穩(wěn)定劑用于食品、化妝品、醫(yī)藥中。但VC在水溶液中極不穩(wěn)定，易被空氣中氧和其他氧化劑所氧化；氧化生成的脫氫抗壞血酸就迅速不可逆地進一步氧化或分解成古洛糖酸或其他氧化產(chǎn)物，喪失VC原有的生理活性。VC若暴露于中性pH、熱、光和重金屬下，也會快速降解。

研究者[32]利用CGTase的轉(zhuǎn)糖基作用，將葡萄糖基轉(zhuǎn)接于L-抗壞血酸的C2上，得到VC衍生物2-O-葡萄糖基-L-抗壞血酸（2-O-α-glucopyranosyl-L-ascorbic acid，AA-2αG，結(jié)構(gòu)式見圖1），這種化合物由于在2位上有葡萄糖基掩蔽，不會發(fā)生氧化反應(yīng)。因此，它在水溶液中特別穩(wěn)定，本身并無直接還原性。AA-2αG在進入細胞時可由細胞膜上的α-葡萄糖苷酶水解，產(chǎn)生的VC則被轉(zhuǎn)運到體內(nèi)，在體內(nèi)發(fā)揮VC的多種生理功能[33]。由于AA-2αG是由生物轉(zhuǎn)化法合成，安全無毒，可作為穩(wěn)定劑、品質(zhì)改良劑、生理活性劑、紫外線吸收劑用于食品、飲料工業(yè)中；也可以作為化學(xué)和醫(yī)藥原料用于醫(yī)藥工業(yè)中。

圖1 2-O-葡萄糖基-L-抗壞血酸的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of 2-O-α-glucopyranosyl-L-ascorbic acid

目前研究者已經(jīng)利用多種方法，包括化學(xué)合成法等生產(chǎn)出多種VC的衍生物，如抗壞血酸脂肪酸酯、抗壞血酸金屬鹽類等，而利用CGTase對抗壞血酸進行酶法改性獲得AA-2αG，無疑是對VC衍生物產(chǎn)品開發(fā)的補充和拓展，產(chǎn)品的經(jīng)濟價值較VC亦有很大的提升。

3.2 對甜味劑的改善作用

天然甜味劑甜菊苷是從甜葉菊葉子等植物部位中提取，含多種成分的糖苷混合物。它的各種成分的含量、口感和甜度各不相同。其中主要的糖苷為stevioside和rebaudioside A[34]。二者甜度高、熱量低，因此在食品工業(yè)中有非常好的應(yīng)用前景。但是二者均有一定的苦味和不愉快的后味，影響了它們的應(yīng)用。

Abelyan[35]用多種微生物來源的CGTase，用β-環(huán)糊精作為葡萄糖基供體，對stevioside進行酶法改性。反應(yīng)后獲得了9種衍生產(chǎn)物，其中的兩種4″-O-α-D-和4蓯-O-α-D-glucosyl stevioside具有最好的口味。Kochikyan[36]則利用淀粉作為葡萄糖基供體對stevioside和rebaudioside A進行酶法改性。

Jaitak[37]利用超聲和微波輔助反應(yīng)（MAR），用來源于Bacillus firmus的β-CGTase，對stevioside進行酶法改性。轉(zhuǎn)糖基酶反應(yīng)在1min內(nèi)即可完成，得到產(chǎn)物為4′-O-α-D-glycosyl stevioside和4″-O-α-D-maltosyl stevioside，產(chǎn)量分別為66%和24%。優(yōu)化后的MAR反應(yīng)體系為：5mL磷酸納緩沖體系（pH7）；stevioside量，1.24mmol；β-環(huán)糊精量，1.76mmol；溫度：50℃；微波爐（2450MHz，300 W）的功率：80W。

甜菊苷和其衍生物具有多種的生物活性；利用CGTase酶法改性甜菊苷是去除其后苦澀味的有效方法，但目前利用CGTase對甜菊苷的改性基本還處在實驗室的研究階段。隨著對CGTase酶促轉(zhuǎn)糖基機理的研究深入，有望實現(xiàn)改性甜菊苷的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

3.3 對蘆丁的改性作用

蘆?。≧utin）為黃酮類化合物，在自然界中廣泛分布。蘆丁具有廣泛的藥理活性，臨床上可用于多種疾病的預(yù)防和治療。此外，蘆丁在食品工業(yè)中還可以作為抗氧化劑和天然色素加以利用[38]。但是，由于蘆丁的水溶性差，性質(zhì)也不穩(wěn)定，其應(yīng)用和商業(yè)價值均受到影響。研究者嘗試?yán)酶鞣N方法，對蘆丁進行改性以改善蘆丁的理化性質(zhì)；其中包括利用CGTase對蘆丁進行酶法改性[39-41]。蘆丁經(jīng)酶法糖基化后得到的蘆丁衍生物葡萄糖基蘆丁（分子結(jié)構(gòu)見圖2），水溶性大大提高（約提高了4×104倍），同時穩(wěn)定性也得到提高。

在蘆丁糖基化反應(yīng)體系中，甲醇作為蘆丁的溶劑，體積約占反應(yīng)體系體積的一半。這可能會在以后的生產(chǎn)中對操作者的健康產(chǎn)生不利的影響，此外甲醇的殘存也可能影響產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)生安全性等問題，但是在實驗中，暫時還未找到甲醇的替代品來用作蘆丁的溶劑[16]。

圖2 葡萄糖基蘆丁的結(jié)構(gòu)[27]Fig.2 Structure of glucopyranosyl rutin[27]

4 CGTase在面包烘焙中的應(yīng)用

CGTase應(yīng)用于面包烘焙，可以改善面包的品質(zhì)，如增加面包體積、改善面包質(zhì)構(gòu)、延緩面包的老化。Mutsaers[42]研究表明，將CGTase添加到面包生面團之中，可以增加小麥淀粉顆粒的膨脹能力和溶解性，進而可以顯著增加烘焙產(chǎn)品的體積。Jemli[43]研究報道則稱，在面包烘焙前，面團中加入CGTase不僅可以顯著增加成品面包的體積，而且可以減輕面包在貯藏過程中的硬化，即減緩面包的老化過程。其他研究[44-45]亦得到類似的研究結(jié)果。

CGTase抗面包老化可歸因于：一方面是CGTase有效水解淀粉，避免支鏈淀粉結(jié)晶；另一方面是由于生成的環(huán)糊精同面粉里存在的脂類形成復(fù)合物，降低支鏈淀粉的回生[46]。Martin[44]也認(rèn)為CGTase轉(zhuǎn)化生成的環(huán)糊精對延緩面包的老化發(fā)揮重要作用。

無麩質(zhì)食品，如米粉面包是針對麩質(zhì)過敏癥患者研究開發(fā)的專用食品。但是米粉面包的老化比小麥面包更為嚴(yán)重，主要原因在于相比于小麥淀粉，大米淀粉更容易老化。米粉面包還存在面包體積（?。┖唾|(zhì)構(gòu)差等問題。Gujral[47]研究報道，在制作米粉面包時添加CGTase可以減緩面包的老化；并且減緩面包老化的效果要優(yōu)于添加α-淀粉酶。此外，米粉面包中添加CGTase還能增大面包的體積，改善面包的形狀和質(zhì)地，其原因是生成的環(huán)糊精增加了疏水蛋白的溶解性并參與“捕獲”CO2，從而增大米粉面包的體積，改善成品面包的質(zhì)構(gòu)[48]。

5 展望

CGTase具多種催化活性，用途比較廣泛，但目前研究主要集中在利用CGTase進行環(huán)糊精的生產(chǎn)上。未來CGTase的研究，可能會從菌種的篩選開始，朝多用途、多方向的目標(biāo)發(fā)展。CGTase的分子改造也會成為以后研究的熱點。分子改造的目標(biāo)主要在于：使CGTase催化反應(yīng)的產(chǎn)物更加專一，比如轉(zhuǎn)化淀粉生成的產(chǎn)物為3種主要環(huán)糊精中的一個，或其中的某種環(huán)糊精占絕大多數(shù)比例；CGTase耐熱，pH范圍廣，生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)等。此外CGTase基因工程菌的研究也會引起研究者更多的興趣，但需要指出的是，CGTase主要應(yīng)用于食品工業(yè)，因此不能忽略基因工程菌所產(chǎn)的重組酶安全性方面的研究。

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Production of Cyclodextrin glucanotransferases and their applications in food industry

SUN Tao1，JIANG Bo2，PAN Bei-lei3，*
（1.School of Perfume and Aroma Technology，Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Chinese Institute of Food Science and Technology，Beijing 100006，China）

TS201.2+6

A

1002-0306（2012）16-0387-06

2012－02－01 *通訊聯(lián)系人

孫濤（1969-），男，博士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)與食品添加劑。

上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院引進人才基金。