納豆激酶對(duì)角叉菜膠所致小鼠血栓模型的影響

劉彥霞，陳 文，溫宗妍，趙肖萌

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191）

納豆激酶對(duì)角叉菜膠所致小鼠血栓模型的影響

劉彥霞，陳 文，溫宗妍，趙肖萌

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191）

目的：觀察納豆激酶對(duì)角叉菜膠所致的小鼠血栓模型的影響，為納豆激酶相關(guān)產(chǎn)品的溶血栓功能性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法：將雌性昆明種小鼠隨機(jī)分為4組：空白組、模型對(duì)照組、低劑量組、高劑量組。連續(xù)灌胃30d，每天一次，于第30d，除空白組外，其他3組均用角叉菜膠制備尾部血栓模型，24h后觀察并測(cè)量黑尾長(zhǎng)度，之后摘眼球取血，測(cè)定血清纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP）、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）、組織型纖溶酶原激活劑抑制劑1（PAI-1）的含量。結(jié)果：各組小鼠最后一次稱重體重?zé)o顯著性差異；低劑量組與高劑量組的出栓率低于模型對(duì)照組，但模型對(duì)照組、低劑量組、高劑量組三組間相比較，黑尾長(zhǎng)度、黑尾/全尾長(zhǎng)的無(wú)顯著性差異（p＞0.05）；高劑量組小鼠血清中的FDP及t-PA的含量顯著高于模型對(duì)照組和低劑量組（p＜0.05）；空白組未檢出PAI-1，其余各組PAI-1的含量無(wú)顯著性差異。結(jié)論：納豆激酶對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)血栓具有溶解作用，可以降低血栓的發(fā)生率；角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠血栓模型可以用于納豆激酶溶（抗）血栓功能評(píng)價(jià)。

納豆激酶，角叉菜膠，小鼠，尾部血栓

Abstract：Objective：Observed effect of nattokinase on the tail-thrombus model，and provided basis for the function evaluation of nattokinase product.Methods：The mice were randomly allocated into four groups（each group with 12 mice），including the normal group，the model control group，the low-dose nattokinase group，and the high-dose nattokinase group.Weighing up the mice was done every 7d.After the mice were fed for 30d，except for the normal group，other 3 groups were used to establish tail-thrombus models with carrageenan.After models were established for 24h，we observed the length of dark tails，and then detected the Fibrinogen degradation product（FDP），tissue type plasminogen activator（t-PA），and tissue type plasminogen activator inhibitor（PAI-1） in serum.Results：There was no significant difference between the length of dark tails among the model control group，the low-dose nattokinase group and the high-dose nattokinase group（p＞0.05），but the dark tail rates of the later two group were lower than the former one.The values of FDP and t-PA of the high-dose nattokinase group were higher than those of the model control group and the low-dose nattokinase group（p＜0.05）.no PAI-1 was detected in the normal，and other groups had similar values of PAI-1.Conclusions：Nattokinase was effective in dissolving blood clots，and dropping incidence of disease.Carrageenan induced tail-thrombus model could be used to evaluate the antithrombotic and fibrinolysis enhancing effects of nattokinase.

Key words：nattokinase；carrageenan；mice；tail-thrombus

血栓栓塞性疾病是目前嚴(yán)重危害中老年人健康的疾病，其發(fā)病率高，致殘致死率高。要減輕這一疾病的危害，重點(diǎn)在于預(yù)防。納豆是日本的一種傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，由蒸煮后的大豆接入枯草芽孢桿菌發(fā)酵而成。納豆激酶（NK）是一種由納豆菌或納豆產(chǎn)生的堿性絲氨酸蛋白酶[1]，具有溶栓作用，與現(xiàn)有的溶栓劑如尿激酶、鏈激酶相比，在體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，能溫和持續(xù)地提高血液的纖溶活性，同時(shí)不易引起出血[2]，因而受到生物醫(yī)學(xué)與食品界的廣泛關(guān)注[2-6]。所以市場(chǎng)上出現(xiàn)了多種納豆激酶保健食品，且都口頭宣稱自己的產(chǎn)品具有良好的溶栓效果。然而，與之相對(duì)應(yīng)的納豆激酶溶栓活性的檢測(cè)方法卻發(fā)展相對(duì)滯后，衛(wèi)生部2003年《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中沒(méi)有抗血栓或溶血栓的功能聲稱。因此無(wú)法對(duì)市場(chǎng)中宣傳具有溶血栓功能的相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行有效監(jiān)管。角叉菜膠誘導(dǎo)鼠科動(dòng)物尾部血栓模型制備方法簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員技術(shù)要求不高，在適宜的環(huán)境條件下可以實(shí)現(xiàn)較高的造模成功率。造模過(guò)程不需要?dú)⒑?dòng)物，對(duì)動(dòng)物的傷害相對(duì)較小。因?yàn)檠ǔ霈F(xiàn)在尾部，而且血栓的程度易于觀察和測(cè)量，適合對(duì)血栓形成過(guò)程的動(dòng)態(tài)觀察[7-8]。另外，該模型對(duì)象是實(shí)驗(yàn)室小動(dòng)物，所需費(fèi)用較少?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，該動(dòng)物模型已經(jīng)在食品的抗血栓功能評(píng)價(jià)方面得到較為廣泛的應(yīng)用[9-13]。如戎冬梅等[9]對(duì)比了飲酒對(duì)小鼠尾部血栓形成的影響，各組小鼠于造模后12～48h測(cè)量小鼠黑尾長(zhǎng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量白酒組的小鼠比模型對(duì)照組及低劑量白酒組中小鼠的體重低，黑尾也明顯增長(zhǎng)，表明隨著酒量的加大，血栓形成的危險(xiǎn)增加。繆紅等[12]采用角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓模型研究黃岑中黃酮類物質(zhì)對(duì)血栓形成的影響。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物灌胃不同劑量的受試物，對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水，于第5d給受試物1h后制備模型，之后24～72h觀察動(dòng)物黑尾發(fā)生率及黑尾長(zhǎng)度，結(jié)果表明黃芩莖葉明顯降低了小鼠黑尾發(fā)生率。本研究旨在利用角叉菜膠所致小鼠尾部血栓模型，觀察納豆激酶對(duì)角叉菜膠所致血栓形成的影響以及其溶栓機(jī)制，為納豆激酶相關(guān)產(chǎn)品的抗血栓功能性評(píng)價(jià)方法的制定提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雌性昆明種小鼠48只，體重約28g左右，購(gòu)于北京華阜康生物科技有限公司（許可證號(hào)SCXK-（京）2009-0007），飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測(cè)中心SPF級(jí)動(dòng)物室（許可證號(hào)SYXK-（京）2007-0020）；角叉菜膠C1013-25G，Type I，Sigma公司，批次#021M0038V；ELISA試劑盒（FDP、t-PA、PAI） 武漢華美生物工程有限公司；納豆激酶 樣品活力350mg=5000FU，浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司。

游標(biāo)卡尺，BioTek酶標(biāo)儀ELx808，Sartorius BS233S分析天平，Anke TDL-5型離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將48只小鼠常規(guī)喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組：空白組、模型對(duì)照組、低劑量組、高劑量組，各12只。各組均采用灌胃途徑，按100μL/10g·bw的灌胃量給藥，喂食30d，其中每7d稱重1次。

表1 分組及其處理方式Table 1 Groups and the treatments

1.2.2 小鼠血栓模型的制備 于第30d開(kāi)始造模，精密稱取角叉菜膠，以生理鹽水配成0.2g/100mL的質(zhì)量濃度；小鼠稱重后，采取腹腔注射角叉菜膠，注射劑量為100μL/10g·bw。造模后將小鼠置于（17±2）℃的環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2.3 小鼠尾部血栓形成長(zhǎng)度的測(cè)定 因在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，48h時(shí)小鼠尾部血栓部位已經(jīng)開(kāi)始部分脫落，其黑尾長(zhǎng)度已經(jīng)沒(méi)有意義，所以選擇在造模24h后，以游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠尾長(zhǎng)及黑尾長(zhǎng)度。然后，各組小鼠被摘除眼球取血，分離血清，分裝于潔凈離心管中，-20℃冰箱冷藏備用。

1.2.4 小鼠纖溶功能指標(biāo)的測(cè)定 根據(jù)ELISA試劑盒操作說(shuō)明方法測(cè)定血清FDP、t-PA、PAI。測(cè)試前將試劑盒和血清置于室溫中至少平衡30min。

ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)“Curve Exert1.3”軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 納豆激酶對(duì)小鼠體重的影響

由表2可以看出，在30d灌胃期間，各組平均體重一直處于增長(zhǎng)狀態(tài)中。其中，低劑量組與高劑量組體重增長(zhǎng)相近，均略低于空白組與模型對(duì)照組。

在實(shí)驗(yàn)前分組時(shí)，各組小鼠間體重?zé)o差異（p＞0.05）。經(jīng)過(guò)了30d蒸餾水或納豆激酶灌胃后，各組動(dòng)物的體重都明顯的增加了（p＜0.05）。在最后一次測(cè)量體重時(shí)，灌胃納豆激酶的小鼠體重與空白組、模型對(duì)照組的體重沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），說(shuō)明納豆激酶不會(huì)影響小鼠的正常生長(zhǎng)。

表2 實(shí)驗(yàn)前后小鼠體重的變化（±s，n=12）Table 2 The change of mice body weigh（t±s，n=12）

表2 實(shí)驗(yàn)前后小鼠體重的變化（±s，n=12）Table 2 The change of mice body weigh（t±s，n=12）

注：*表示同一組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前后體重相比較，有顯著性差異（p＜0.05）。

灌胃第30d造模前體重（g）空白組 27.50±1.53 36.60±2.30*模型對(duì)照組 28.06±1.14 36.88±2.19*納豆激酶低劑量組 28.00±0.61 34.95±1.67*納豆激酶高劑量組 27.94±0.82 35.17±2.22*組別 開(kāi)始灌胃前體重（g）

2.2 納豆激酶對(duì)小鼠黑尾形成的影響

由表3可知，造模24h后，空白組小鼠黑尾形成率為0，模型對(duì)照組黑尾形成率為100%，說(shuō)明造模成功；低劑量與高劑量組小鼠黑尾形成率均為91.67%，說(shuō)明灌胃納豆激酶可以一定程度上降低由角叉菜膠所誘導(dǎo)尾部血栓的形成率。模型對(duì)照組、低劑量組、高劑量組黑尾長(zhǎng)度、黑尾/全尾長(zhǎng)的差異無(wú)顯著性（p＞0.05），表明灌胃納豆激酶不能降低所出現(xiàn)血栓的程度。

表3 納豆激酶對(duì)小鼠黑尾形成的影響（±s，n=12）Table 3 Impact of nattokinase on the forming rate of tail-thrombus in mice（±s，n=12）

表3 納豆激酶對(duì)小鼠黑尾形成的影響（±s，n=12）Table 3 Impact of nattokinase on the forming rate of tail-thrombus in mice（±s，n=12）

組別 黑尾長(zhǎng)度（cm） 黑尾/全尾長(zhǎng) 黑尾形成率（%）空白組 0 0 0模型對(duì)照組 3.42±1.66 0.33±0.16 100%低劑量組 3.38±2.34 0.33±0.23 91.67%高劑量組 3.49±1.91 0.34±0.19 91.67%

2.3 納豆激酶對(duì)小鼠體內(nèi)纖溶功能的影響

表4中為納豆激酶對(duì)小鼠纖溶系統(tǒng)功能幾項(xiàng)指標(biāo)的影響，如表4所示，模型對(duì)照組及納豆激酶低、高劑量組中FDP的含量均比空白組顯著增加（p＜0.05）。FDP是綜合反映纖溶亢進(jìn)的指標(biāo)，既包括纖溶酶降解纖維蛋白之后的產(chǎn)物（FDP），也包括降解纖維蛋白原之后的產(chǎn)物（FiDP）。模型對(duì)照組小鼠血清中的FDP含量顯著高于空白組（p＜0.05），說(shuō)明血栓造模后小鼠體內(nèi)自身的纖溶系統(tǒng)啟動(dòng)，所生成的纖維蛋白原降解產(chǎn)物增多；高劑量組顯著高于模型對(duì)照組（p＜0.05），表明高劑量的納豆激酶能夠增強(qiáng)小鼠纖溶系統(tǒng)的功能；而低劑量組與模型空白的FDP值之間沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），低劑量納豆激酶沒(méi)有起到增強(qiáng)小鼠纖溶系統(tǒng)功能的作用；高劑量組小鼠血清中的FDP含量顯著高于低劑量組（p＜0.05），表明納豆激酶增強(qiáng)小鼠纖溶系統(tǒng)活性的能力存在量效關(guān)系。

表4 納豆激酶對(duì)小鼠纖溶系統(tǒng)功能指標(biāo)的影響（±s，n=12）Table 4 Impact of nattokinase on serum FDP、t-PA、PAI-1 of mice（±s，n=12）

表4 納豆激酶對(duì)小鼠纖溶系統(tǒng)功能指標(biāo)的影響（±s，n=12）Table 4 Impact of nattokinase on serum FDP、t-PA、PAI-1 of mice（±s，n=12）

注：nd：表示沒(méi)有未檢出；*表示與空白組相比較有顯著性差異（p＜0.05）；▲表示與模型對(duì)照組及低劑量組相比較有顯著性差異（p＜0.05）。

組別 FDP（μg/L） t-PA（μg/L） PAI-1（μg/L）空白組 7.03±2.44 1.78±0.25 nd模型對(duì)照組 12.28±3.16* 23.25±1.84* 3.33±0.98低劑量組 10.84±4.46* 24.62±3.07* 3.22±1.12高劑量組 16.12±2.17*▲ 30.11±4.24*▲ 2.87±0.52

t-PA與PAI-1分別是組織型纖溶酶原激活劑與抑制劑。在正常情況下，纖溶酶以酶原的形式存在，只有在t-PA的作用下，才能轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶。PAI在纖溶過(guò)程中起著重要作用，PAI-1是t-PA主要的抑制劑，二者含量的變化對(duì)血漿促凝和抗凝的功能狀態(tài)有影響。如表4所示，造模后各處理組小鼠血清t-PA值都顯著高于空白組（p＜0.05）；同時(shí)高劑量組中t-PA含量明顯高于模型對(duì)照組與低劑量組（p＜0.05），說(shuō)明喂食高劑量納豆激酶可以顯著增加小鼠血清t-PA的含量，且存在一定的量效關(guān)系?？瞻捉M中沒(méi)有檢測(cè)出PAI-1，因?yàn)樾∈笤谡顟B(tài)t-PA與PAI-1保持一定的比例關(guān)系，在前者含量很低的情況下，后者的含量也很低，所以沒(méi)有檢測(cè)到PAI-1。而其他各組中均檢測(cè)出含有PAI-1，高劑量組中PAI-1的值較模型對(duì)照組及低劑量組低，但各組之間不存在顯著性差異（p＞0.05），表明喂食納豆激酶對(duì)PAI-1的含量沒(méi)有明顯影響。

3 討論

自從1987年日本的Sumi H等人發(fā)現(xiàn)納豆中存在可以溶解血栓纖維蛋白的成分-納豆激酶以后[14]，已經(jīng)有很多學(xué)者對(duì)納豆激酶的結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)以及藥效等方面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有多方面保健作用，但其纖溶作用比較突出，該方面的研究居多。

段智變等[15]通過(guò)20%FeCl3制備兔頸動(dòng)脈血栓模型，并利用日本大耳兔觀察納豆激酶粗酶液的體內(nèi)溶血栓作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量組給藥2h后，F(xiàn)DP含量明顯增高；張利[16]用電刺激血栓形成法給藥后制備大鼠頸動(dòng)脈血栓模型，觀察從血栓形成到動(dòng)脈血流完全阻斷所需要的時(shí)間，對(duì)納豆激酶溶血栓作進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)納豆激酶均能顯著地延長(zhǎng)血流阻斷所需的時(shí)間；實(shí)驗(yàn)同時(shí)還利用日本大耳兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用股動(dòng)脈富含紅細(xì)胞血栓模型，研究了納豆激酶對(duì)兔股動(dòng)脈栓塞的再通作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組無(wú)一側(cè)股動(dòng)脈再通，而給予納豆激酶后約40min，兔股動(dòng)脈平均血流量恢復(fù)50%以上，F(xiàn)DP檢測(cè)結(jié)果明顯增高，表明納豆激酶具有較強(qiáng)的體內(nèi)溶栓作用；在對(duì)其溶栓機(jī)理進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，納豆激酶可顯著提高t-PA的含量及活性，而對(duì)PAI-1的含量無(wú)明顯影響，表明納豆激酶可以通過(guò)激活t-PA來(lái)發(fā)揮溶栓作用的，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相同。毛娜娜[17]利用腎上腺素加冰浴制備大鼠急性血瘀模型，并通過(guò)Real Time PCR觀察納豆激酶對(duì)大鼠主動(dòng)脈t-PA、PAI-1基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)納豆激酶可明顯增加t-PA mRNA的表達(dá)，但對(duì)PAI-1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯性影響。

本實(shí)驗(yàn)中采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用簡(jiǎn)單的動(dòng)物模型對(duì)納豆激酶的纖溶活性進(jìn)行了研究。在研究納豆激酶對(duì)黑尾形成率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，灌胃一定劑量的納豆激酶可以起到降低黑尾發(fā)生率也即血栓發(fā)病率的作用。同時(shí)，對(duì)其纖溶機(jī)制進(jìn)行研究的結(jié)果表明，喂食高劑量的納豆激酶能夠提高t-PA的值，對(duì)PAI-1沒(méi)有顯著影響，F(xiàn)DP含量有顯著增加。

4 結(jié)論

納豆激酶對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)血栓具有溶解作用從而起到預(yù)防血栓發(fā)生的效果，能夠降低血栓的發(fā)病率；角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠血栓模型可以用于納豆激酶溶（抗）血栓功能評(píng)價(jià)，通過(guò)黑尾的發(fā)生率進(jìn)行初步判斷，同時(shí)對(duì)其纖溶功能的生化指標(biāo)如FDP、t-PA、PAI-1的檢測(cè)值進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

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Impact of nattokinase on carrageenan induced tail-thrombus mice

LIU Yan-xia，CHEN Wen，WEN Zong-yan，ZHAO Xiao-meng
（Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods，College of Arts and Science，Beijing Union University，Beijing 100191，China）

TS201.4

A

1002-0306（2012）20-0330-04

2012－07－19

劉彥霞（1976－），女，博士，助理研究員，研究方向：保健食品功能評(píng)價(jià)研究。

北京市教委科技計(jì)劃面上項(xiàng)目（KM201211417005）；北京聯(lián)合大學(xué)人才強(qiáng)校計(jì)劃人才資助項(xiàng)目。