落葉松樹(shù)皮原花青素提取工藝的研究

崔曉霞，張小麗，羅書(shū)勤，張力平

北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083

原花青素是1967年美國(guó)人最早從葡萄皮和葡萄籽中提取分離出4種多酚化合物，得到的多酚化合物在酸性介質(zhì)中加熱均可產(chǎn)生花青素(cyanidins)，故將這類(lèi)多酚化合物命名為原花青素［1］(Proanthocyanidins，PC)。有人將其歸為生物類(lèi)黃酮，也有人將其歸為縮合鞣質(zhì)。原花色素是植物體內(nèi)生成的復(fù)雜多酚類(lèi)物質(zhì)，原花青素為其中分布最廣、數(shù)量最多的一種［2］。原花青素廣泛分布于植物界，如葡萄、蘋(píng)果等水果中和山楂的皮、核、梗以及黑荊樹(shù)、松樹(shù)皮、銀杏、野生刺葵、番荔枝等植物中，也存在于某些飲料(茶葉、啤酒)、蔬菜和糧食中，與人類(lèi)生活和健康密切相關(guān)［3-5］。原花青素具有多種化學(xué)與生物活性，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏和保護(hù)心血管和預(yù)防高血壓、抗腫瘤和抗輻射等功能，在食品、保健品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景［6］。

落葉松屬松科落葉松屬植物，分布于我國(guó)東北，為大、小興安嶺海拔300～1200 m地帶的主要林木，俄羅斯(遠(yuǎn)東地區(qū))也有分布。樹(shù)皮中含有豐富的原花青素類(lèi)化合物［7-9］，是一種極具利用價(jià)值的綠色資源。為了充分利用落葉松樹(shù)皮資源，確定其最佳的活性物質(zhì)原花青素的提取工藝，本文以落葉松樹(shù)皮為原料，采用超聲提取法對(duì)原花青素的提取工藝進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

原料:落葉松樹(shù)皮由內(nèi)蒙古拓孚林化有限責(zé)任公司提供。

試劑:原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，含量≥95%，天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司;色譜甲醇，J.T.Baker(USA);無(wú)水乙醇、鹽酸、正丁醇、十二水合硫酸鐵銨，均為分析純，北京化工廠。

儀器設(shè)備:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RE52CS-1型，上海亞榮生化儀器廠;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV-1801型，北京瑞利分析儀器公司;數(shù)控超聲波清洗器，KQ5200DB型，昆山市超聲儀器有限公司;全自動(dòng)精密分析天平，TG328A型，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DHG-9030A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 落葉松樹(shù)皮中原花青素的提取方法

將落葉松樹(shù)皮粉碎至30～40目，準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g于500 mL錐形瓶中，加入200 mL一定濃度的乙醇溶液浸泡24 h，在一定的料液比、乙醇濃度和提取溫度下超聲提取一段時(shí)間，取出真空抽濾，濾液經(jīng)減壓濃縮后置于30℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，得到原花青素粗品。研究料液比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響。并以乙醇濃度、超聲時(shí)間、料液比、提取溫度設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1)，探討最佳工藝條件。為了提高試驗(yàn)精度，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)兩次。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確稱(chēng)取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容，配制成0.00、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別取1 mL各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的具塞試管中，依次加入0.2 mL 2%的鹽酸-硫酸鐵銨溶液、6 mL正丁醇－鹽酸溶液，混合均勻后在95℃的熱水中加熱反應(yīng)40 min，取出后立即冷卻至室溫。以甲醇溶液為空白，用紫外分光光度計(jì)在546 nm處測(cè)定其吸光度值，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，見(jiàn)圖1。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣點(diǎn)進(jìn)行線(xiàn)性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程:y=2.636x-0.0026 ，R2=0.9992，其中 x 為濃度(mg/mL)，y 為吸光度，R2為相關(guān)性因數(shù)。

圖1 Bate-Smith法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 the standard curve of the Bate-Smith analysis method

1.2.3 原花青素含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg原花青素用適量甲醇溶解，定容至50 mL。取上述溶液1 mL于10 mL具塞試管中，依次加入0.2 mL 2%的鹽酸-硫酸鐵銨溶液、6 mL正丁醇－鹽酸溶液，混合均勻后于95℃的熱水中反應(yīng)40 min，取出后立即冷卻至室溫。以甲醇溶液作為空白，用紫外分光光度計(jì)在546 nm處測(cè)得其吸光度值。并根據(jù)回歸方程計(jì)算待測(cè)液中的原花青素的含量，其公式為:

式中:Ym為原花青素的得率，%;m1為原花青素粗提物的質(zhì)量，g;m2為落葉松樹(shù)皮的質(zhì)量，g;w為落葉松樹(shù)皮的含水率，%;X為被測(cè)樣品原花青素的含量，%;A為吸光度值;T為原花青素的提取率，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件對(duì)原花青素提取率的影響

2.1.1 料液比對(duì)原花青素提取率的影響

圖2 料液比對(duì)超聲提取的影響Fig.2 Effects of solvent to material ratio on ultrasonic extraction

由圖2可知，隨著料液比的增大，原花青素的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)。提取溶劑的用量越大，其提取效率則越好。但是，在一定量的提取溶劑中，原花青素已經(jīng)全部溶出，再增加提取溶劑的用量并不能提高提取率，這是因?yàn)槿軇┻^(guò)多時(shí)，超聲波的能量對(duì)沉淀底層的落葉松樹(shù)皮顆粒的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)的強(qiáng)度減弱，影響超聲提取的效果。因此選擇最佳料液比為1∶15。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)原花青素提取率的影響

圖3 乙醇濃度對(duì)超聲提取的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on ultrasonic extraction

由圖3可知，隨著乙醇濃度的提高，原花青素的提取率增大，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)提取率達(dá)到最大值。水是典型的強(qiáng)極性溶劑，介電常數(shù)很大，而乙醇的極性相對(duì)要弱一些，調(diào)節(jié)乙醇和水的配比能夠調(diào)節(jié)萃取溶劑的極性。原花青素為極性化合物，根據(jù)相似相溶原理，選擇適宜的乙醇和水的配比可以提高原花青素的提取率和純度。

圖4 提取溫度對(duì)超聲提取的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on ultrasonic extraction

2.1.3 提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響由

圖4可知，隨著溫度的升高，原花青素的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為35℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值。溫度升高會(huì)提高物質(zhì)的溶出，但如果進(jìn)一步升高，則會(huì)導(dǎo)致原花青素氧化分解，雜質(zhì)溶出量增加，影響提取效率。因此，選擇35℃為落葉松樹(shù)皮原花青素的最佳提取溫度。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響

圖5 超聲時(shí)間對(duì)超聲提取的影響Fig.5 Effects of extraction time on ultrasonic extraction

由圖5可知，超聲時(shí)間較短時(shí)，原花青素不易溶出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)原花青素的提取率也會(huì)隨之提高，超聲時(shí)間為30 min時(shí)提取率達(dá)到最高。但是隨著超聲時(shí)間的增加，落葉松樹(shù)皮內(nèi)外組分濃度逐漸趨于平衡，物質(zhì)難以溶出，而且提取時(shí)間的延長(zhǎng)還會(huì)導(dǎo)致其受熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而變性，從而導(dǎo)致提取率下降，因此確定最佳超聲波作用時(shí)間為30 min。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

按1.2.1所述L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平安排，考察松樹(shù)皮中原花青素的提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知，乙醇濃度、超聲時(shí)間、料液比和提取溫度等四個(gè)因素對(duì)原花青素的提取效果均有顯著影響。對(duì)落葉松樹(shù)皮中原花青素提取率影響的主次順序?yàn)?D＞B＞A＞C，即提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇濃度＞料液比，且A1B1C1D3為最佳方案，即乙醇濃度為50%，超聲提取時(shí)間為0.5 h，料液比取1∶15，提取溫度為35℃。

2.3 落葉松樹(shù)皮原花青素含量的測(cè)定

按照1.2.3的方法測(cè)定落葉松樹(shù)皮原花青素粗品的含量，其紫外分析結(jié)果如圖6所示。

圖6 落葉松樹(shù)皮超聲提取物的紫外光譜圖Fig.6 UV absorption spectrum of larch bark OPC by ultraphonic

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［10］，正丁醇-鹽酸法測(cè)定原花青素的原理是基于其花色素反應(yīng)，即原花青素在熱酸作用下能產(chǎn)生紅色物質(zhì)，從而可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于單體原花青素黃烷-3，4-二醇來(lái)說(shuō)，C-4位具有極強(qiáng)的親電性，其醇羥基與C-5，C-7上的酚羥基組成一個(gè)芐醇系統(tǒng)，使得4位碳易于形成正碳離子。在強(qiáng)酸作用下，正碳離子失去質(zhì)子，氧化生成花色素。對(duì)于聚合原花青素，其單元間連接鍵易在酸作用下被打開(kāi)，下部單元生成黃烷-3-醇，上部單元生成花色素。落葉松樹(shù)皮原花青素粗品的紫外分析結(jié)果表明，落葉松樹(shù)皮的提取物在正丁醇-鹽酸體系中熱后成為紅色，即發(fā)生了花色素反應(yīng)，而且在546nm處出現(xiàn)明顯的紫外吸收峰，由此可以初步判斷出落葉松樹(shù)皮中含有原花青素。

3 結(jié)論

本文研究了料液比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響，并利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)落葉松樹(shù)皮原花青素的提取工藝進(jìn)行了研究，通過(guò)結(jié)果分析及實(shí)際生產(chǎn)考慮確定的最佳提取工藝為:乙醇濃度為50%，超聲提取時(shí)間為0.5 h，料液比取1∶15，提取溫度為35℃，其提取率為17.52%。紫外分析表明，落葉松樹(shù)皮提取物在熱酸作用下在546 nm左右具有特征吸收峰，即本實(shí)驗(yàn)提取出的落葉松樹(shù)皮提取物中含有原花青素成分。

1 Celestino SB，Augustin S.Proanthocyanidins and tannin-like compounds-nature，occurrence dietary intake and effects on nutrition and health.J Sci Food Agric，2000，80:1094-1117.

2 Sun DW(孫達(dá)旺).植物單寧化學(xué).北京:中國(guó)林業(yè)出版社，1992:130-142.

3 Porter L，Hrstich L，Chan B.Photochemistry，1986，25:223-230.

4 Lee YA，Cho EJ，Yokozawa T.Effects of Proanthocyanidin Preparations on Hyperlipidemia and Other Biomarkers in Mouse Model of Type 2 Diabetes.2008，J Agric Food Chem，56:7781-7789.

5 Zhang ZS(張澤生)，Zhao CY(趙春艷)，Xu Y(徐英)，et al.Study on extracting procedure of proanthocyanidins form hawthorn fruit.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2007，19:127-130.

6 Shrikhande Anil J.Wine by-products with health benefits.Food Res Inter，2000，33:469-474.

7 Mun SP，Ku CS.Characterization of low molecular weight polyphenols from pine(Pinus radiata)bark.Food Sci Biotechnol，2006，15:424-430.

8 Chang Sub Ku，Sung PhilMun.Characterization of proanthocyanidin in hot water extract isolated from Pinus radiate bark.Wood Sci Technol，2007，41:235-247.

9 Li BY，Cheng M，Gao HQ，et al.Back-regulation of six oxidative stress proteins with grape seed proanthocyanidin extracts in rat diabetic nephropathy.J Cell Biochem，2008，104:668-679.

10 Bate-Smith，E.C.Phytochemistry of proanthocyanidins.1975，Phytochemistry，14:1107-1113.