GnRH在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義①

劉曉霞 宗 珊 李 真 張麗紅 岳 瑛 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，長春130021)

促性腺激素釋放激素(Gonadotropin releasing hormone，GnRH)是由下丘腦弓狀核神經(jīng)細(xì)胞分泌的一種十肽激素，通過垂體門脈系統(tǒng)釋放，與垂體前葉的GnRH受體(Gonadotropin releasing hormone receptor，GnRHR)結(jié)合，通過刺激垂體促性腺激素細(xì)胞分泌促性腺激素，促進(jìn)性腺分泌特異性激素，對生殖器官、乳腺、腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺和骨骼生長發(fā)揮作用［1］。GnRH除了通過下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamus-pituitary-gonadal axis，HPG)發(fā)揮作用外，還發(fā)現(xiàn)許多腦外組織中存在GnRH，通過自分泌/旁分泌作用作為重要介質(zhì)和其他生物因子一起，構(gòu)成復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)［2］。在多種人類惡性腫瘤中存在以GnRH為基礎(chǔ)的自分泌系統(tǒng)［3］。近年來，有關(guān)GnRH的基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用及GnRH類似物、Gn-RH-R的研究與傳統(tǒng)觀點不同，認(rèn)為垂體外正常組織包括大腦、乳腺、卵巢、睪丸、前列腺、胎盤組織等存在GnRH-R，在乳腺癌、卵巢上皮性癌、子宮內(nèi)膜腺癌等性激素依賴性惡性腫瘤組織中也有高親和力的GnRH-R表達(dá)［4］。目前國內(nèi)外關(guān)于GnRH在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)研究極少。本實驗通過免疫組化及原位雜交兩種實驗方法，分別從蛋白質(zhì)及核酸水平研究GnRH在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，以探討其臨床意義。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來源 標(biāo)本共65例，來源于2008年8月至2010年3月在吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院婦產(chǎn)科確診的患者，年齡范圍24歲至74歲，平均年齡46．8歲，全部病例均無化療、放療及免疫治療史，亦未經(jīng)口服藥物治療。分別為慢性宮頸炎20例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌45例(Ⅰb期12例，Ⅱa期21例，Ⅱb期以上12例)。

1．2 標(biāo)本的處理 標(biāo)本離體后用DEPC(焦碳酸二乙酯，C6H10O5)滅活RNA酶的去離子水固定，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)病理科制成石蠟標(biāo)本。均經(jīng)術(shù)后常規(guī)病理檢查明確診斷。

1．3 免疫組化方法 操作步驟按試劑盒內(nèi)說明進(jìn)行。GnRH鼠抗人多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，超敏S-P免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1．4 原位雜交方法 操作步驟按試劑盒內(nèi)說明進(jìn)行。GnRH原位雜交試劑盒購于天津市灝洋生物制品科技有限公司。GnRH探針合成序列5'-CTTCTTCTGCCCAGTTTCCTCTTCAATCA-3'探針適合于人。

1．5 陽性結(jié)果判定

1．5．1 定性判定 以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物為陽性，以PBS代替一抗或滴加陰性對照探針雜交液作為陰性對照。按染色深淺及陽性細(xì)胞數(shù)多少，采用雙盲法分為:(－)無陽性細(xì)胞，(+)陽性細(xì)胞數(shù)＜10%或染成淺棕色，(++)陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%之間或染色介于深淺棕色之間，(+++)陽性細(xì)胞數(shù)＞50%或染成深棕色。

1．5．2 定量判定 采用連續(xù)成像顯微鏡照相，應(yīng)用IPP(Image-Pro Plus)軟件進(jìn)行圖像分析處理，對宮頸鱗狀細(xì)胞癌定性檢測為陽性的組織中GnRH和GnRH mRNA相對含量進(jìn)行定量分析。輸入方式為普通光源照明，顯微鏡放大400倍。固定輸入條件后，每張切片隨機抽取10個單位面積，測定陽性細(xì)胞的平均灰度，計算出每個單位面積GnRH和Gn-RH mRNA的相對含量。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，對計數(shù)資料采用卡方檢驗、四格表確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計，對計量資料采用秩和檢驗，以P＜0．05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2．1 免疫組織化學(xué)檢測方法結(jié)果 GnRH在慢性宮頸炎及宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)。

2．1．1 定性結(jié)果 在20例慢性宮頸炎上皮組織中GnRH表達(dá)均為陰性(見圖1);在45例宮頸癌組織中，存在GnRH陽性信號的有36例。鏡下可見宮頸癌細(xì)胞為陽性細(xì)胞，陽性物質(zhì)主要分布在癌細(xì)胞胞質(zhì)，為棕黃色，細(xì)胞核淡染或不著色(見圖2)。在兩組組織中GnRH陽性表達(dá)率分別為0%和80%(36/45)，兩 組 比 較 差 異 有 顯 著 性 (χ2=35．86，P＜0．000 1);GnRH在不同臨床期別宮頸癌組織中表達(dá)率比較，各組之間比較差異有顯著性(P=0．005 4，＜0．05)，見表1。

表1 GnRH在慢性宮頸炎上皮和宮頸癌組織中表達(dá)率比較Tab．1 The expression of GnRH in chronic cervicitis and cervical cancer

表2 不同臨床期別宮頸癌組織單位面積GnRH相對含量比較Tab．2 The relative content of GnRH in different clinical stage cervical cancer

圖3 原位雜交方法檢測GnRH mRNA在慢性宮頸炎中的陰性表達(dá)(×400)Fig．3 Situ hybridization detection about GnRH mRNA negative expression in chronic cervicitis(×400)

2．1．2 定量結(jié)果 圖像分析結(jié)果示:不同臨床期別宮頸癌組織單位面積GnRH相對含量比較差異無顯著性(P ＞0．05)，見表2。

2．2 原位雜交結(jié)果 GnRH mRNA在慢性宮頸炎及宮頸癌中的表達(dá)。

2．2．1 定性結(jié)果 在20例慢性宮頸炎上皮組織中GnRH mRNA表達(dá)均為陰性(見圖3);在45例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，存在GnRH mRNA陽性信號的有29例。GnRH mRNA在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿中，呈棕黃色，胞核淡染或不著色(見圖4)。在兩組組織中GnRH mRNA陽性表達(dá)率分別為0%和64．44%(29/45)，兩組比較差異有顯著性(χ2=16．91，＜0．000 1)，見表 3。表 4 為GnRH mRNA在不同臨床期別宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)率比較，各組之間比較差異有顯著性(P＜0．05)。

圖4 原位雜交方法檢測GnRH mRNA在宮頸癌中的陽性表達(dá)(×400)Fig．4 Situ hybridization detection about GnRH mRNA negative expression in cervical cancer(×400)

表3 GnRH mRNA在慢性宮頸炎上皮和宮頸癌組織中表達(dá)率比較Tab．3 The expression of GnRH mRNA in chronic cervicitis and cervical epithelial tissues

表4 GnRH mRNA在不同臨床分期宮頸癌組織中表達(dá)率比較Tab．4 The expression of GnRH mRNA in different clinical stages of cervical cancer tissues

表5 不同臨床期別宮頸癌組織單位面積GnRH mRNA相對含量比較Tab．5 The relative content of GnRH mRNA in differentclinical stage cervical cancer

2．2．2 定量結(jié)果 圖像分析結(jié)果示:不同臨床期別宮頸癌組織單位面積GnRH相對含量比較差異有顯著性(P ＜0．05，見表5)。

3 討論

宮頸癌(Cervical cancer)又稱宮頸浸潤癌(Invasive carcinoma of cervix uteri)，是最常見的婦科惡性腫瘤，其病理類型以鱗狀細(xì)胞癌最為多見，占宮頸癌的80%～85%。目前宮頸癌的主要病因是人乳頭瘤病毒(HPV)的感染，并不是性激素依賴性腫瘤，但使用雌、孕激素配伍的口服避孕藥可以增加宮頸癌發(fā)病的危險，是因為激素直接刺激宮頸組織增生及使頸管外翻增加暴露于致癌物的機會［3］。且丁玲等［5］通過研究發(fā)現(xiàn)，高水平的內(nèi)源性激素與宮頸癌的發(fā)生有密切關(guān)系。GnRH在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中均有表達(dá)，GnRH的增高即可使性激素升高，作為婦科惡性腫瘤之一的宮頸癌，是否也有GnRH的表達(dá)目前不十分明確。

本實驗收集45例宮頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本和20例慢性宮頸炎標(biāo)本進(jìn)行研究，通過免疫組化和原位雜交兩種實驗方法分別從蛋白質(zhì)和核酸水平來檢測GnRH在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)慢性宮頸炎標(biāo)本中GnRH及GnRH mRNA均為陰性，癌細(xì)胞GnRH免疫組化方法染色陽性率為80%(36/45)，與慢性宮頸炎比較差異有顯著性(P＜0．05);原位雜交方法在癌細(xì)胞胞質(zhì)中也檢測到較強的GnRH mRNA陽性雜交信號，其陽性率為64．44%(29/45)，與慢性宮頸炎比較差異有顯著性(P＜0．05)，說明在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中無論在蛋白質(zhì)水平還是在核酸水平均存在GnRH。對不同期別宮頸鱗狀細(xì)胞癌中GnRH及GnRH mRNA比較，在定性上不同期別均有顯著差異;而定量上在蛋白質(zhì)水平Gn-RH 無顯著差異(P=0．883 1，P ＞0．05)，在核酸水平GnRH mRNA含量有差異(P=0．034 6，P＜0．05)。從此結(jié)果上分析其原因，表明宮頸癌可能是具有自身合成GnRH的作用，雖然不同臨床期別宮頸癌組織單位面積GnRH相對含量比較差異無顯著性，但是GnRH在不同臨床期別宮頸癌組織中表達(dá)率比較，各組之間比較差異有顯著性。不同期別宮頸鱗狀細(xì)胞癌中定量上在蛋白質(zhì)水平GnRH無顯著差異，在核酸水平GnRH mRNA含量有差異，說明GnRH轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平在不同分期之間的不協(xié)同性，癌組織中GnRH轉(zhuǎn)錄和翻譯水平陽性表達(dá)率不一致的結(jié)果說明，該腫瘤組織中可能不僅有自分泌途徑影響GnRH蛋白水平的表達(dá)，尚存在旁分泌等其他途徑。

有文獻(xiàn)報道，抗GnRH抗體可降低血清雌激素水平，抗GnRH抗體抑制腫瘤生長的一個機制是通過降低血清雌激素水平來實現(xiàn)的，即認(rèn)為抗GnRH抗體的抑瘤效應(yīng)是間接發(fā)揮的［6］。本實驗通過免疫組化及原位雜交的實驗方法，檢測出在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中GnRH及GnRH mRNA高表達(dá)，說明宮頸癌組織可能通過自分泌/旁分泌機制產(chǎn)生GnRH，GnRH應(yīng)是參與宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展調(diào)節(jié)的一個因素。因此推測如應(yīng)用抗GnRH抗體來治療宮頸癌，既通過降低血清雌激素水平間接實現(xiàn)，又通過與宮頸癌組織中的GnRH結(jié)合而直接實現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用是有可能性的，是為應(yīng)用抗GnRH抗體治療宮頸癌的實驗提供了一定的理論基礎(chǔ)。為了減少較晚期宮頸癌治療后的腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高生存率，術(shù)后的放、化療治療是不可缺少的，且目前宮頸癌的治療越來越提倡新輔助化療，即在手術(shù)之前或放療之前對宮頸癌患者先進(jìn)行全身化學(xué)藥物治療，現(xiàn)已成為共識［7］。因此利用宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞表面GnRH表達(dá)增加的結(jié)果，選擇應(yīng)用其抗體來抑制宮頸癌細(xì)胞生長的方法，是我們今后治療宮頸癌的一個新思路。

1 郎景和．第七屆促性腺激素釋放激素類似物在癌癥及人類生殖的應(yīng)用國際研討會紀(jì)要［J］．中華婦產(chǎn)科雜志，2003;38(9):590-592．

2 張 萍．促性腺激素釋放激素系統(tǒng)與婦科腫瘤的研究進(jìn)展［J］．上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005;25(5):535-537．

3 孫杰茹，崔玉蘭，陳雪梅主編．婦科腫瘤臨床診療學(xué)［M］．哈爾濱:哈爾濱工程大學(xué)出版社，2004:63-63．

4 Grundker C，Gunthert A R，Millar R P et al．Expression of hormone gonadotropin—releasing hormone II(GnRH-II)receptor in human endometrial and ovarian cancer cells and effects of GnRH-II on tumor cell proliferation［J］．Clin Endocrinol Metab，2002;87:1427-1430.

5 丁 玲，王金桃，程玉英 et al．雌激素、孕激素與宮頸癌關(guān)系的病例對照研究［J］．山西醫(yī)藥雜志，2006;35(2):95-97．

6 Paradiso A，Pezzetta A，Cellamare G et al．GnRH receptors in human breast cancer and its contiguous not-involved breast tissue［J］．J Endocrinol Invest，2000;23:90-96．

7 范 新，孫 陽，趙 琳．晚期宮頸癌的動脈灌注化療［J］．大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002;24(2):107-109．