瘤內(nèi)注射MIP-3α對小鼠肝癌生長抑制作用的研究①

王甲南 向邦德 劉 星 趙蔭農(nóng) (廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，南寧530021)

樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是目前已知的功能最強的抗原遞呈細(xì)胞。由于位于腫瘤微環(huán)境中的DCs，即腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞(Tumor infiltrating dendritic cells，TIDCs)，可將腫瘤抗原提呈給初始T細(xì)胞并誘發(fā)特異性抗腫瘤免疫，所以TIDCs在腫瘤免疫中的作用逐漸受到關(guān)注［1-3］?，F(xiàn)已明確多種趨化因子對DCs具有趨化作用，其中巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3α(Macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α)是最為有效的趨化因子之一［4，5］。在本實驗中，我們通過建立小鼠皮下肝癌模型，采用瘤內(nèi)注射MIP-3α的治療方式，對腫瘤生長情況、小鼠生存時間進(jìn)行了觀察，并檢測了腫瘤內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞的數(shù)量及表型，探討了MIP-3α能否在小鼠肝癌病灶內(nèi)趨化、募集外周的樹突狀細(xì)胞，使之在原位有效地攝取并提呈腫瘤抗原，誘導(dǎo)針對肝癌細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答，以達(dá)到控制腫瘤進(jìn)展的目的。

1 材料與方法

1．1 主要試劑及用品 重組鼠源 MIP-3α購自PEPROTECH公司;精制胰蛋白酶粉劑、高糖DMEM基本培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自Hyclone公司;膠原酶IV購自Sigma公司;CD4+免疫組化抗體購于福州邁新生物公司;CD8+、DC-SIGN+免疫組化抗體購自Abcam公司;FITC-CD11c、PE-cy5-CD80及PE-CD86單克隆抗體為eBioScience公司產(chǎn)品;注射用青霉素和鏈霉素為華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1．2 實驗動物和細(xì)胞株 4周齡雌性清潔級(SPF)C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司，于清潔級動物實驗室內(nèi)飼養(yǎng)。小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞資源中心。

1．3 儀器與設(shè)備 BD公司產(chǎn)FACScalibur流式細(xì)胞儀，heat force HF24細(xì)胞培養(yǎng)箱，Millipore級別純凈水分離儀，SANYO －70℃超低溫冰箱，細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作臺等。

1．4 方法

1．4．1 C57BL/6J小鼠皮下肝癌模型的建立 Hepa1-6細(xì)胞復(fù)蘇后用高糖DMEM完全細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期Hepa1-6細(xì)胞，PBS重懸，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至5×106ml-1，移液器量取100 μl細(xì)胞懸液并接種于C57BL/6J小鼠胸脅部皮下。接種后觀察腫瘤生長情況，取接種成功者作為實驗對象。

1．4．2 MIP-3α溶液的配制 無菌條件下將MIP-3α粉末以2 μg/ml的濃度溶于高壓滅菌后的PBS中。分裝后置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1．4．3 實驗分組及實驗方法 于Hepa1-6細(xì)胞接種后第10天將成功建立皮下肝癌模型的小鼠(腫瘤長徑達(dá)7～10 mm者)隨機分為3組:MIP-3α治療組、PBS對照組、空白對照組。分別向MIP-3α治療組、PBS對照組的小鼠瘤內(nèi)注射100 μl MIP-3α溶液及100 μl PBS，每日1次，共持續(xù) 3周，空白對照組小鼠不予任何處理，其中治療組小鼠的MIP-3α 注射劑量為 0．2 μg/(只·天)。

1．4．4 CD4+、CD8+細(xì)胞及 DCs免疫組織化學(xué)法染色 于治療實驗結(jié)束后第2天(腫瘤接種后第31天)，頸椎離斷法處死全部3組實驗動物。切開皮膚取出腫瘤組織標(biāo)本，100 ml/L中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。免疫組化染色步驟按各抗體生產(chǎn)公司試劑盒說明書操作;采用DAB染色，陽性細(xì)胞為胞膜及胞漿棕黃染色。

1．4．5 腫瘤浸潤性DCs的定量檢測及表型分析小鼠處死時間及腫瘤組織取得方法同前。將腫瘤組織剪碎后，加入10 ml膠原酶Ⅳ置于培養(yǎng)箱6小時，消化為單細(xì)胞懸液后200目篩網(wǎng)過濾，PBS漂洗2次，再向細(xì)胞懸液加入CD11c、CD80及CD86單克隆抗體，避光孵育20分鐘，再以PBS漂洗1次后，行流式細(xì)胞術(shù)檢測各組腫瘤組織內(nèi)浸潤DCs的數(shù)量及CD80、CD86的表達(dá)。

1．4．6 腫瘤生長曲線的繪制及荷瘤小鼠生存期觀察 腫瘤細(xì)胞接種后每日觀察腫瘤生長情況，種植成功者第7天即可捫及皮下結(jié)節(jié)(長徑可達(dá)5～8 mm)。腫瘤細(xì)胞接種后第10天起，每3天測量腫瘤直徑1次。腫瘤體積計算公式:腫瘤體積(mm3)=a×b2/2。a為腫瘤長徑，b為短徑。當(dāng)荷瘤小鼠出現(xiàn)下列情況時，結(jié)束觀察并予以處死:①腫瘤長徑超過20 mm。②腫瘤表面皮膚破潰、感染或出血。③出現(xiàn)明顯的惡液質(zhì)表現(xiàn)。

1．5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，方差分析 SNK法進(jìn)行比較，不滿足方差齊性的資料對數(shù)轉(zhuǎn)換后滿足方差齊性再進(jìn)行比較;采用重復(fù)測量設(shè)計比較各測量時間點小鼠腫瘤體積，Log-rank檢驗比較小鼠生存時間。檢驗水準(zhǔn)，P＜0．05。

2 結(jié)果

2．1 各組小鼠腫瘤內(nèi)CD4+、CD8+細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的浸潤情況 腫瘤接種后第31天處死全部動物后，收集腫瘤組織標(biāo)本。免疫組化染色后，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察各張切片可見，MIP-3α治療組小鼠(n=6)腫瘤內(nèi)浸潤的CD4+、CD8+細(xì)胞及DCs的陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯高于PBS對照組(n=5)及空白對照組(n=4)。陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜及細(xì)胞漿染色(見圖1)。

2．2 各組小鼠腫瘤性浸潤DCs數(shù)量及表型的比較通過流式細(xì)胞儀分析各組小鼠腫瘤細(xì)胞懸液，結(jié)果顯示，MIP-3α治療組小鼠(n=4)的TIDCs數(shù)量占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比例為(2．56±1．07)%，顯著高于PBS對照組(n=3)(1．15±0．38)%及空白對照組(n=4)(1．03 ±0．40)%(P=0．035)，PBS 對照組、空白對照組間無顯著差別。同時對各組TIDCs的表型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示MIP-3α治療組小鼠的TIDCs表面標(biāo)志CD80/CD86的表達(dá)較對照組上調(diào)(P值分別為0．012、0．019)，其中 MIP-3α 治療組小鼠 TIDCs的CD80表達(dá)率為(73．58±7．37)%，高于PBS對照組(28．03 ±14．42)及空白對照組(38．74 ±22．1);MIP-3α治療組小鼠TIDCs的CD86表達(dá)率為(7．52±3．25)%，而PBS對照組及空白對照組分別為(2．93±1．82)%和(2．15 ±0．44)%，見圖2、3。

2．3 各組小鼠皮下肝癌體積的比較 腫瘤直徑測量于治療試驗結(jié)束后第2天，即腫瘤細(xì)胞接種后第31天終止，繪制各組小鼠(n=10)腫瘤生長曲線(見圖4)。結(jié)果顯示，在予MIP-3α治療期間，治療組小鼠腫瘤體積及生長速率均明顯低于對照組(P＜0．001)。第30天MIP-3α治療組小鼠平均腫瘤體積為(797．2 ±325．1)mm3，顯著小于 PBS對照組(1713．1 ±333．0)mm3及空白對照組(1625．1 ±441．6)mm3(P ＜0．001)，而兩對照組間比較無顯著差別。

2．4 各組小鼠生存時間的比較 MIP-3α治療組小鼠(n=10)生存時間為42～70天，中位生存時間為54天，平均生存時間為54．5天，95%可信區(qū)間為48．0～51．0天;PBS對照組小鼠(n=10)生存時間為39～54天，中位生存時間為42天，平均生存時間為44．7 天，95%可信區(qū)間為41．6 ～47．8 天;空白對照組小鼠(n=10)生存時間為39～57天，中位生存時間為45天，平均生存時間為46．5天，95%可信區(qū)間為42．9～50．1天。MIP-3α治療組與各對照組小鼠的生存時間存在顯著性差異(P＜0．05)。兩對照組間生存期差別無統(tǒng)計學(xué)意義。各組小鼠生存曲線見圖5。

圖3 MIP-3α治療組(n=4)與PBS(n=3)、空白對照組(n=4)小鼠 TIDCs數(shù)量及 CD80+TIDCs、CD86+TIDCs數(shù)量的對比Fig．3 The number of TIDCs and CD80+TIDCs，CD86+TIDCs in MIP-3α therapy group(n=4)，PBS control group(n=3)and blank control group(n=4)

圖4 各組小鼠皮下接種Hepa1-6細(xì)胞后腫瘤生長曲線(n=10)Fig．4 Tumor growth curve of mice injected Hepa1-6 cells in each group(n=10)

圖5 各組小鼠生存曲線(n=10)Fig．5 Survival curves of mice in each group(n=10)

3 討論

DCs是目前已知的功能最強的抗原遞呈細(xì)胞，在啟動、調(diào)控及維持免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮極為重要的作用。由于DCs在腫瘤免疫應(yīng)答中處于中心環(huán)節(jié)，所以位于腫瘤微環(huán)境的DCs，即腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞(TIDCs)逐漸受到關(guān)注。臨床實驗結(jié)果顯示，TIDCs的浸潤程度與多種惡性腫瘤患者的生存期及預(yù)后關(guān)系密切［1-3］。所以設(shè)法增加TIDCs的數(shù)量從而誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答成為一種新的免疫治療思路和手段。

目前已知多種細(xì)胞因子可對DCs產(chǎn)生趨化作用，其中 MIP-3α 是最為有效的趨化因子之一［4，5］。MIP-3α屬CC類趨化因子，在人和鼠的多種炎癥組織中表達(dá)，其特異性受體為高表達(dá)于未成熟的樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，imDCs)表面的CCR6。MIP-3α與CCR6結(jié)合后可使imDC在體內(nèi)發(fā)生定向遷移［6］。當(dāng)imDCs捕獲抗原后，轉(zhuǎn)而表達(dá)CCR7，分化為成熟的樹突狀細(xì)胞(mature dendritic cells，mDCs)，并失去對 MIP-3α 的反應(yīng)性［7］。所以，MIP-3α在體內(nèi)對imDCs具有很強的趨化能力，但不能將mDCs招募至腫瘤灶內(nèi)或炎癥部位。利用MIP-3α 這一生物學(xué)功能，F(xiàn)ushimi等［8］將編碼 MIP-3α 的cDNA經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染至小鼠黑色素瘤、Lewis肺癌等四種不同的惡性腫瘤細(xì)胞系后建立皮下模型，發(fā)現(xiàn)MIP-3α治療組中小鼠腫瘤組織內(nèi)浸潤的DCs的數(shù)量顯著高于對照組;Choi等［7］采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立了可表達(dá)人類MIP-3α的小鼠胸腺癌模型，觀察到相近的實驗結(jié)果。在本次研究中，我們采用更具臨床實用意義的瘤內(nèi)注射治療方式，證實外源性MIP-3α亦可有效地將DCs趨化至小鼠肝癌灶內(nèi)，并抑制腫瘤生長，使荷瘤小鼠的生存期得以延長。

在攝取抗原后，imDCs隨即降低CCR1、CCR5、CCR6等趨化因子受體的表達(dá)，而MHCⅡ類分子及共刺激分子(CD40、CD80、CD86等)的表達(dá)升高，這些免疫細(xì)胞膜分子表達(dá)的改變使得imDCs獲得成熟表型及功能。imDCs的抗原遞呈功能微弱，而mDCs提呈抗原及刺激初始T細(xì)胞的能力則顯著增強?，F(xiàn)已明確，惡性腫瘤宿主體內(nèi)常發(fā)生DCs功能的紊亂，腫瘤細(xì)胞可通過多種方式逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視［9，10］，且不同腫瘤對 DCs功能的影響機制不盡相同［9，11-13］。所以，腫瘤細(xì)胞通過腫瘤微環(huán)境對DCs功能的抑制繼而產(chǎn)生的腫瘤免疫逃避現(xiàn)象已成為腫瘤免疫治療研究中不容回避的問題。Furumoto等［14］的實驗結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染后的小鼠黑色素瘤細(xì)胞所分泌的MIP-3α并不能促進(jìn)TIDCS成熟，需同時向瘤內(nèi)注射免疫佐劑CpG，方能誘導(dǎo)TIDCs成熟。然而我們在實驗中卻發(fā)現(xiàn)，單獨向小鼠皮下肝癌模型內(nèi)注射 MIP-3α后，TIDCs表面 CD80、CD86的表達(dá)均有一定程度的上調(diào)，并在統(tǒng)計學(xué)上與對照組呈現(xiàn)顯著差異性，這與Choi等［7］在小鼠胸腺癌模型上取得的研究結(jié)果吻合。上述不一致的實驗結(jié)果提示，MIP-3α能否單獨或需其他細(xì)胞因子協(xié)同促進(jìn)DCs成熟，可能取決于不同腫瘤的局部微環(huán)境。

在次級淋巴組織內(nèi)，已成熟的DCs與特異性T細(xì)胞直接接觸并穩(wěn)定結(jié)合，分別以MHCⅡ類、MHCⅠ類分子限制性的方式將抗原提呈給 CD4+及CD8+T細(xì)胞，可使其大量增殖并成為具備特異性殺傷功能的效應(yīng)T細(xì)胞，即細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)。多數(shù) CTL為CD8+T細(xì)胞，通過FasL/Fas、顆粒酶等途徑殺傷腫瘤細(xì)胞。約10%的CTL為CD4+T細(xì)胞，活化后亦可通過“旁觀者效應(yīng)”直接殺傷靶細(xì)胞及周圍無關(guān)細(xì)胞，而CD4+Th細(xì)胞則在激活DCs及產(chǎn)生記憶性CD8+T細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用［15，16］，所以維持乃至提高 CD4+與CD8+T細(xì)胞浸潤的數(shù)量是產(chǎn)生腫瘤免疫應(yīng)答及清除腫瘤的關(guān)鍵。我們的實驗結(jié)果顯示，瘤內(nèi)注射重組鼠源MIP-3α后，治療組瘤內(nèi)CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組，且腫瘤的生長速度明顯延緩。Furumoto等［14］發(fā)現(xiàn)，將轉(zhuǎn)染 MIP-3α 基因的結(jié)腸癌細(xì)胞種植于小鼠皮下，實體瘤形成后不僅TIDCs及浸潤于瘤內(nèi)的CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而且脾源性CTL的體外殺傷活性也顯著增強。我們推測，外源性MIP-3α或腫瘤細(xì)胞分泌的MIP-3α首先將imDCs募集至癌灶內(nèi)，隨后攝取了腫瘤抗原的imDCs在MIP-3α或其他細(xì)胞因子的協(xié)同作用下，在一定程度上解除了腫瘤微環(huán)境的抑制效應(yīng)，完成成熟過程后再將腫瘤抗原遞呈給CD4+、CD8+T細(xì)胞，后者可大量增殖并產(chǎn)生針對腫瘤細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答，有效殺傷腫瘤細(xì)胞，這可能是上述實驗中腫瘤體積增長受到抑制的重要原因。

新近有臨床研究證明，MIP-3α可趨化多種表達(dá)CCR6的人類腫瘤細(xì)胞遷移，提示MIP-3α可能在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的過程中起到關(guān)鍵作用［17-19］。Rubie等［20］發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌(Hepatic cell carcinoma，HCC)組織的CCR6表達(dá)上調(diào)，且CCR6的高表達(dá)常伴隨MIP-3α的表達(dá)升高;Uchida等［21］則報道HCC患者發(fā)生肝內(nèi)播散的概率與肝癌細(xì)胞的CCR6表達(dá)水平呈正相關(guān)。但我們及其他研究小組卻在動物實驗中得到相反的結(jié)果［7，8，14，22］，F(xiàn)ushimi［8］、Furumoto［14］等則進(jìn)一步證明，MIP-3α趨化DCs完成抗原提呈后，實驗鼠可產(chǎn)生針對腫瘤抗原的免疫記憶，能有效遏制遠(yuǎn)處同種腫瘤的生長。我們考慮:動物模型腫瘤為移植性腫瘤，人類腫瘤則為宿主自體產(chǎn)生，后者免疫原性相對較弱;動物模型腫瘤多位于皮下，不累及實質(zhì)器官，而發(fā)生在重要臟器的惡性腫瘤患者，其免疫系統(tǒng)常常受到抑制，因而削弱了由MIP-3α誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，另一方面MIP-3α與CCR6的相互作用卻加劇了腫瘤細(xì)胞的惡性行為，這可能是導(dǎo)致臨床與動物實驗結(jié)果產(chǎn)生矛盾的原因。

由于已發(fā)現(xiàn)的特異性相對較高的肝癌抗原(如甲胎蛋白等)多為胚胎抗原，宿主往往對其耐受，且目前仍未發(fā)現(xiàn)其他明確的肝癌特異性抗原，所以通過利用DCs提呈未知的肝癌相關(guān)抗原并在體內(nèi)誘導(dǎo)針對肝癌細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答，仍將是肝癌免疫治療研究的重要手段。與利用DCs疫苗的免疫過繼療法相比，利用MIP-3α對DCs獨特的趨化作用誘導(dǎo)體內(nèi)DCs提呈抗原更符合生理原則，且更易向臨床過渡，值得進(jìn)一步研究。

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